一株革兰氏阳性菌对猪去氧胆酸和猪胆酸生物转化的研究

欧阳文凯，盛敏，蔡帅，李跃忠，李国军，邓家国，谢小国，万里平，李刚

（常德云港生物科技有限公司，湖南常德 415001）

甾体化合物又称类固醇化合物，是环戊烷多氢菲类化合物的总称，普遍存在于动植物体内[1]。甾体母核包含3个六元环和1个五元环，结构式见图1。不同的甾体化合物的区别主要在于其C17位置上的取代基团不同以及甾体母核上双键位置的不同[2]。本研究所用原料猪去氧胆酸（HDCA）和猪胆酸（HCA）属于2种不同的甾体化合物，结构式见图2。

图1 甾体母核

图2 猪去氧胆酸（a）和猪胆酸（b）结构

甾体类化合物包括性激素类、固醇类、胆汁酸、维生素D、肾上腺素、强心苷元、抗生素和昆虫蜕皮皮激素等。近年来，甾体类药物逐步上升为仅次于抗生素的第二大药物，具有很高的药物价值[3]。

目前，甾体类药物的合成方法主要分为化学方法和生物方法。化学方法容易对环境造成污染，合成工艺复杂，且某些化合物通过化学方法难以合成，而生物转化具有转化率高、副产物少、对环境危害小等优点，受到了国内外学者的广泛研究[4]。微生物对甾体化合物的每个位置几乎都能进行转化，其中几种常见的反应类型包括羟基化反应、脱氢反应、氢化反应以及环氧化反应[5]。

羟基化反应是指在有机物各个基团上引入羟基的反应。羟基化反应是生物转化过程中较为常见的一种反应，早在1952年MURRAY等[6]就发现了黑根霉能高效转化黄体酮为11α-羟基黄体酮；李宴清等[7]的研究表明，其筛选分离得到的一株斜卧青霉菌能将16,17α-环氧黄体酮转化为7β-羟基-16α,17α-环氧黄体酮和7β,11α-双羟基-16α,17α-环氧黄体酮两种产物，其中7β-羟基-16α,17α-环氧黄体酮为底物在7号位引入一个羟基得来，7β,11α-双羟基-16α,17α-环氧黄体酮为前者在11号位引入一个羟基得来。YE等人[8]的研究表明，他们分离出的一株真菌能将远华蟾蜍精12号位碳原子特异性羟基化，得到了6种羟基化后的产物。

脱氢反应为氧化反应的一种形式，是减少有机化合物中氢原子数目的过程。CATROUX等[9]在醋酸可的松的1,2位上引入双键形成醋酸脱氢可的松，抗炎效果增加了4倍左右；SMITH等[10]的研究分离出了7株能使6号和7号位孕酮和雄烯二酮B环脱氢的真菌。

氢化反应是指有机化合物和氢分子发生反应。FARAMARZI等[11]在对菌株AcremoniumstrictumPTCC 5282生物转化1,4-雄甾二烯-3,17-二酮（ADD）的过程中发现，在发酵的第1天，ADD 17位碳原子上的酮基就被还原为羟基；PANG等[12]的研究也发现Burkholderia cepaciaSE-1可将16α,17α-环氧孕烯醇酮加氢还原为20-羟基-16α,17α-环氧孕甾-4-烯-3-酮。

环氧化反应是指在化合物双键两端碳原子间加上一原子氧形成三元环的氧化反应。ÖZÇINAR等[13]对新鲁斯可皂苷元进行生物转化研究的过程中，发现尤里卡农杆菌主要影响皂苷元B和C环上的氧化和环氧化反应；ALFOOTY等人[14]的研究发现毛霉菌（Mucor plumbeus）能够将17β-乙酸基-5α-雄甾-3-烯环氧化化为7β-乙酸基-3α,4α-环氧-5α-雄甾烷。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 培养基配方

筛选培养基：HDCA 0.3%（或HCA 0.3%）、硫酸铵0.1%、磷酸二氢钾0.1%、磷酸氢二钾0.1%、氯化钠0.05%、硫酸锌0.002%、硫酸亚铁0.001%、无菌水，pH值7.5左右（加2%琼脂即为固体培养基）。

LB培养基：酵母膏5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化钠5 g/L、无菌水，pH7.0。另加入琼脂20 g/L即为LB固体培养基。

发酵培养基：酵母膏1.5%、蛋白胨1.0%、氯化钠0.5%、葡萄糖1.0%、磷酸二氢钾0.1%、甘油50.0%、无菌水，pH7.0。

1.1.2 试剂与仪器

硫酸铵、氯化钠、硫酸锌、硫酸亚铁、丙三醇，AR级，湖南汇虹试剂有限公司；磷酸二氢钾，AR级，广东光华科技股份有限公司；磷酸氢二钾，AR级，国药基团化学试剂有限公司；琼脂、酵母浸粉、蛋白胨，BR级，北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖，AR级，西陇科学股份有限公司；革兰氏染色试剂盒，杭州微生物有限公司；猪去氧胆酸（HDCA），常德云港生物科技有限公司；猪胆酸，四川广汉市维康植化有限公司。

GL21M型高速冷冻离心机，常州金坛良友仪器有限公司；BXM-85VE型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；420-BS型电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；THZ-300型恒温培养摇床，上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司；P3100型高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 供试菌株的筛选

取样：于常德云港生物科技有限公司车间门板、下水道、仓库周围泥土、仓库后水沟、围墙边泥土等地点取样，每个地点取样5 g装于10 mL离心管中，4 ℃冰箱保藏。

样品处理及培养：每个样品称取1 g于新的10 mL离心管，加入5 mL无菌生理盐水，充分振荡混匀后静置1 min，然后分别加0.1 mL上清至装有10 mL液体筛选培养基的试管中，每个样品接种2支试管，30 ℃、160 r/min条件下振荡培养3 d，具体视生长情况而定。

分离纯化：对试管初筛培养基中微生物进行分离纯化，每支试管用接种环挑取后划线于固体筛选培养基中，每个单菌落用接种环挑取划线分离，分离后的每个单菌落再经过多次反复划线进行纯化。

保藏：筛选得到可保存的单菌落时，短期保存可直接保存平板于4 ℃冰箱中，长期保存菌种选择用甘油保存。将单菌落接种于保种液体培养基（即筛选培养基）中，30 ℃振荡培养，待菌体生长起来后，与50%甘油1∶1混合，分装至无菌EP管中，封口膜封口后冻存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 供试菌株的革兰氏染色镜检及菌落形态观察

将分离纯化后的菌株接种于固体LB平板，于30 ℃恒温培养箱中培养2 d，用于观察菌落形态及革兰氏染色镜检，革兰氏染色具体操作步骤参考杭州微生物有限公司革兰氏染色试剂盒说明书。

1.2.3 供试菌株发酵转化实验

发酵培养：取甘油管活化后的菌液0.5 mL接种于装有50 mL发酵培养基的三角瓶中，30 ℃、160 r/min条件下振荡培养3 d，观察生长情况结束发酵。

酶制备：发酵结束后，检测pH值，取样镜检。将发酵液用超声破碎仪破碎15～30 min，然后用30%硫酸铵进行盐析，溶解后离心，得到固体酶制剂。

转化实验：取0.5 g HCA（或0.5 g HDCA）于三角瓶，溶于100 mL水，加入酶制剂，调节至与发酵后pH值一致，30 ℃、160 r/min条件振荡培养，每2 d取样一次，进行HPLC和TLC检测，观察底物变化情况。

1.2.4 转化产物的分析、分离与鉴定

转化后样品进行HPLC和TLC检测，经HPLC和TLC检测确认有新物质产生后送至中山大学进行结构鉴定。

（1）薄层色谱（TLC）法分析。取10μL处理好的样品点样于已活化好的GF254硅胶板。展层剂为二氯甲烷∶石油醚∶乙酸乙酯=7∶2∶1，展层完成后，用10%磷钼酸乙醇溶液均匀喷洒至硅胶板上，置于80℃烘箱里干燥30 min，化合物显蓝色，不同产物位置不同。HCA和HDCA标准品处理方法与上述一致。

（2）高效液相（HPLC）法分析。用流动相（色谱纯甲醇∶0.1%磷酸溶液=90∶10）复溶后用0.22 μm的有机膜过滤除杂。HPLC分析条件如表1所示。

表1 HPLC分析条件

2 结果与分析

2.1 供试菌株菌落形态及革兰氏染色结果

菌株SX-1菌落形态如图3（a）所示，菌落为较小的淡黄色圆形菌落，表面光滑，易挑取。菌株SX-1革兰氏染色结果如图3（b）所示，菌株SX-1被染色颜色为紫色，是一株革兰氏阳性菌，细菌形态为圆球状。研究发现能转化甾体化合物的微生物多为革兰氏阳性细菌，如EYSSEN等人[15]的文献报道的一篇关于HCA的生物转化研究中，分离出的一株菌——HDCA-1，能转化猪胆酸HCA为猪去氧胆酸HDCA。

图3 菌株SX-1菌落形态及革兰氏染色结果

2.2 转化产物TLC分析

以HDCA或HCA为唯一碳源，在无机盐培养基中接种菌株SX-1，进行发酵转化，取48 h的转化液进行TLC分析，结果如图4所示。当以HDCA为底物时，发现HDCA并无明显消耗，也没有新的物质产生，说明菌株SX-1对底物HDCA没有明显转化作用。当以HCA为底物时，实验组的HCA完全消失，而且有很明显的新物质产生，说明菌株SX-1对底物HCA有转化作用。

图4 菌株SX-1转化HCA和HDCA的TLC结果分析

2.3 HCA转化产物HPLC分析

为进一步验证TLC结果，对菌株SX-1转化0 h、24 h和48 h的培养基进行取样和HPLC分析，结果如图5～图7所示。从图5中可知，HCA的出峰时间约在9.437 min；如图6所示，当转化时间为24 h时，有2种主要物质能被检测到，其中一个物质的出峰时间是7.460 min，但只占总含量的4.2%，另一个物质的出峰时间是9.392 min，与HCA的保留时间是一致的，占总含量的87.6%，说明只有少量的HCA被转化；如图7所示，当转化时间为48 h时，出峰时间在7 min的物质为优势产物，总含量占到了85.2%，而HCA已经完全被转化。所以，根据TLC和HPLC分析，菌株SX-1对HCA有转化作用，转化效率较高且转化产物稳定。

图5 0.5%HCA的HPLC图

图6 菌株SX-1转化HCA（24 h）HPLC图

图7 菌株SX-1转化HCA（48 h）HPLC图

2.4 HDCA转化产物HPLC分析

本研究同样对HDCA转化产物进行了HPLC分析，结果如图8～图10所示。从图8可知，HDCA的出峰时间为12 min左右；从图9和图10中可知，菌株SX-1在0.5% HDCA存在的无机盐培养基中培养24 h和48 h后，HPLC图无明显变化，12 min左右主峰未见消耗，也无其他时间优势峰产生。结合此前的TLC分析结果，可以判定菌株SX-1对底物HDCA没有转化作用。

图8 0.5%HDCA HPLC图

图9 菌株SX-1转化HDCA（24 h）HPLC图

图10 菌株SX-1转化HDCA（48 h）HPLC图

2.5 转化产物结构鉴定结果

根据TLC分析和HPLC分析，菌株SX-1对HCA有明显转化作用，为进一步确定转化产物结构，将样品送至中山大学进行测定，结果表明转化产物为3,7-二酮基-6α-羟基-胆酸（图11），对转化产物结构进行分析，发现转化产物主要在3号位和7号位发生了脱氢反应，使HCA的3号位和7号位羟基脱氢形成酮基。

图11 猪胆酸及其转化产物化学结构

3 结论

本文以猪去氧胆酸（HDCA）或猪胆酸（HCA）为底物，研究了菌株SX-1（革兰氏阳性细菌）对其生物转化作用。TLC和HPLC结果显示，菌株SX-1对HDCA没有明显转化作用，对HCA有转化作用，48 h后HCA几乎被完全转化，转化产物为3,7-二酮基-6α-羟基-胆酸。SX-1是将HCA的3号位和7号位羟基转化为酮基，可能与菌株SX-1分泌的脱氢酶有关。脱氢反应为微生物转化的主要类型，但国内外文献的报道大多关于C1和C2号位的脱氢，关于C3和C7号位脱氢的报道较少，这为后续研究方向提供了思路。