响应面法优化鸡嗉子果超声波连续逆流提取工艺及香气分析

郑琳，张勃，吴长伟，李仙，蒋美红

（常德华馥生物技术（有限）公司，云南昆明 650000）

鸡嗉子果，別名山覆盆、野荔枝、山荔枝、山枇杷果等，为山茱萸科山茱萸属植物头状四照花的果实，花期5—6月，果期9—10月。鸡嗉子果生于海拔1 600～3 200 m的山坡常绿阔叶林中，林缘或路旁，分布于广西、云南、贵州、四川、西藏、湖南、湖北以及浙江等地。以叶、果入药，秋季采果，鲜用或晒干，叶四季可采，晒干研粉。花、叶和枝含山茱萸苷、根皮酚-β-D-葡萄糖苷，鸡嗉子果有清热解毒、利胆行水、消积杀虫的作用。

目前，鸡嗉子果相关的研究多在农业、食品、医药等方面，而在烟草领域，还未见鸡嗉子果作为烟用添加剂使用的报道或产品。近年来，对于鸡嗉子花、鸡嗉子叶挥发油类化学成分分析等方面已有文献报道[1-8]，鸡嗉子果主要应用在色素提取和酒精饮料领域，对鸡嗉子果制备香精香料产品和超声波连续逆流提取工艺方面的研究较为鲜见。运用超声逆流提取技术提取有效成分，可以有效降低生产成本[9-11]。

本研究以鸡嗉子果为原料，采用超声波连续逆流提取技术提取其主要致香成分，采用响应面设计[12-17]确定了其主要致香成分的最佳提取条件，建立了最优提取工艺，为工业生产提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试材料为鸡嗉子果，产自云南省昆明市。

乙醇，食品级，汕滇药业有限公司；无水硫酸钠，AR，广东汕头市西陇化工厂；二氯甲烷，AR，天津市博迪化工有限公司。

NLTQ-SY超声波连续逆流提取设备，哈尔滨申宜科技有限公司；Agilent 6890N/5975气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；HXC576血液冷藏箱，青岛海尔特种电器有限公司；ME204E电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；NK-505粉碎机，中山市龙的电器实业有限公司；BUCHIR-3000型旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司；LXD-28A型电动离心机，长春市纸张试验厂；HG53型卤素水分测定仪，瑞士Mettler Toledo公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 超声波连续逆流提取工艺

向超声波逆流提取机组内加入乙醇溶剂，调节温度至75 ℃，开启主机和超声波发生器。称取鸡嗉子果2 kg，将其加入投料机漏斗，调节频率，当有排渣时打开流量计阀门，调节流量计，在保持一定的料液比下进行提取，以提取温度、提取时间和溶剂浓度为参数进行响应面试验，后收集分离釜中的提取物并进行处理，对处理后的溶液进行减压浓缩即得鸡嗉子果烟用香料。提取得率计算方法按式（1）计算。

式（1）中：m为鸡嗉子果烟用香料质量，g；M为鸡嗉子果原料质量，g。

1.3 响应面试验设计

选择提取时间、提取温度和溶剂浓度作为超声波逆流提取鸡嗉子果试验的主要影响因素，以提取得率为考察指标，进行3因素3水平试验，见表1。

表1 试验因素水平编码表

1.4 GC-MS分析条件

前处理：称取1.00 g样品，用10 mL二氯甲烷进行溶解，并以适量无水硫酸钠置于4 ℃冰箱脱水24 h后过滤，对滤液进行分析，使用气相色谱-质谱联用仪进行主要致香成分的检测。

仪器检测：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 mm）毛细管柱；进样口温度：240 ℃；载气：He，恒压模式70 kPa；程序升温：50 ℃保持1 min，以8 ℃/min速度升至160 ℃，保持2 min后再以8 ℃/min速度升至260 ℃，保持15 min；进样量：0.5 μL；分流比：25∶1；传输线温度：280 ℃；电离方式：EI；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：160 ℃；质量范围：35～455 aum；溶剂延迟：2 min。

检测模式：SCAN和SIM同步。

谱图检索：所得图谱以计算机谱库（NIST05，Wiley275）进行检索，结合标准质谱图和有关文献[18-20]，并用色谱峰面积归一化法测定得各挥发性成分的峰面积。

2 结果与分析

2.1 响应面试验结果与分析

2.1.1 试验结果

按照响应面法的Box-Behnken Design（BBD）实验方案，采用3因素3水平进行实验，试验设计方案及结果见表2。

表2 BBD试验设计及结果

试验共设计了15个实验点，其中有12个析因点（1～12）和3个中心点（13～15），中心点重复的目的是估计整个实验的纯实验误差，以其挥发性成分的提取率Y作为响应面分析的响应值。

对表2数据进行多元回归拟合，得到鸡嗉子果提取率（Y）对提取温度（A）、提取时间（B）和溶剂浓度（C）的二次多项回归方程模型为：Y=44.79800+0.41375A+0.33250B+0.50625C+0.23750AB-0.26000AC+0.29750BC-0.79650A2-0.86400B2-0.35650C2。具体结果见表3。因素交互作用对鸡嗉子果提取率的响应面分析结果见图1～图3。由结果可以看出，该模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著，说明未知因素对实验结果干扰很小。模型的决定系数R2为0.9971，调整后R2为0.9934，大于0.9，说明模型能解释提取率响应值的变化，模型与实际情况拟合较好，可用于分析和预测超声波连续逆流提取鸡嗉子果的实际情况。

表3 回归方程模型的方差分析结果

图1 提取温度（A）与提取时间（B）对提取得率影响的等高线图及响应面图

图2 提取温度（A）、溶剂浓度（C）对提取得率影响的等高线图及响应面图

图3 提取时间（B）、溶剂浓度（C）对提取得率影响的等高线图及响应面图

由表3可知，一次项A、B和C差异极显著（P＜0.01），说明提取温度、提取时间和溶剂浓度对鸡嗉子果提取率均有极显著影响；二次项A2、B2和C2差异极显著（P＜0.01），说明提取温度、提取时间和溶剂浓度对鸡嗉子果提取率的影响均不是线性关系；AB、AC、BC交互项差异显著（P＜0.05），说明3个因素的交互作用对鸡嗉子果提取率均有显著影响。

2.1.2 试验验证

为了进一步验证该模型的可靠程度，按照最优条件（提取温度78.54 ℃，提取时间68.12 min，溶剂浓度76.92%）进行了验证实验，为了方便生产操作，实际确定最佳提取条件为提取温度为75 ℃，提取时间为60 min，溶剂浓度为75%。鸡嗉子果提取率的平均值为44.79%，与通过Design Expert软件对经手动优化后的回归方程求解得到的预测值44.88%非常接近，说明该模型是比较可靠的，响应面法适用于对鸡嗉子果的超声波连续逆流提取进行回归分析和参数优化。

2.2 鸡嗉子果样品的挥发性成分分析

表4列出了鸡嗉子果挥发性成分。从鸡嗉子果的挥发性成分中共鉴定出42种化合物，利用归一化测定了各种成分的峰面积，其主要成分为α-蒎烯、莰烯、角鲨烯、4-亚甲基-1-(1-甲基乙基)双环[3.1.0]2-己烯等。

表4 鸡嗉子果挥发性化学成分

续表4

3 结论

超声波连续逆流提取鸡嗉子果香料最佳提取条件为提取温度75 ℃、提取时间60 min、溶剂质量浓度75%。从挥发性成分分析结果可以发现，超声波连续逆流提取工艺制备的鸡嗉子果主要挥发性成分有α-蒎烯、莰烯、角鲨烯、4-亚甲基-1-(1-甲基乙基)双环[3.1.0]2-己烯等。这些成分能提升卷烟香气，柔和烟气，添加使用可明显提高卷烟的抽吸品质，是一种可运用于卷烟的烟用香料[21-27]。优选得到的超声波连续逆流提取工艺可行，通过该项研究为超声波连续逆流提取技术开辟经济、高效且定向大规模生产特色鸡嗉子果香料的新途径提供了参考。