淫黄葛合剂诱导HAMP对HT22细胞APP水解中关键酶BACE1表达的影响

刘晓晓，张红军，张非凡，李嘉琪，王雅欣，贺小平，董贤慧

（河北中医学院 河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北石家庄 050000）

阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）是一种多病因介导的神经系统退行性疾病，会导致患者的认知、记忆、语言功能发生障碍。AD的主要病理学标志是脑内老年斑（Senile Plaque，SP）的出现，其核心成分是Aβ。研究表明[1]，AD治疗的关键在于如何抑制Aβ的生成和代谢。

研究发现，淫黄葛合剂可以有效上调HAMP基因的表达[2]，缓解小鼠脑组织铁超载，下调AD小鼠模型Aβ的表达、减少老年斑的沉积，同时明显改善AD学习记忆能力，但其具体机制仍然不明确。

因此，课题组以Aβ25-35诱导HT22细胞为AD细胞模型，淫羊藿、黄芪、葛根素活性成分制成合剂，采用Real-Time PCR分析淫黄葛合剂诱导HAMP对HT22细胞APP水解中关键酶BACE1表达的影响，以期为AD的治疗提供新的思路和策略。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小鼠海马神经元细胞系HT22，由河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室提供。

DMEM高糖培养基，Gibco公司；青链霉素混合液，BIOND公司；3111型二氧化碳培养箱，芬兰Thermo公 司；PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus）试剂盒，TaKaRa公司；DM5000B型光学显微镜、DMI3000B倒置显微镜，德国Leica公司；H2050R型离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；Aβ25-35，Sigma公司；CCK-8试剂盒，庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.2 HT22细胞培养、分组及处理

将HT22细胞进行细胞复苏，加入培养所需营养物质后，放入培养瓶中，置于CO2培养箱中，调好所需的温度与CO2浓度进行培养，细胞融合后进行传代处理。选取形态良好、处于生长期的细胞进行实验。

前期发现[3]，淫黄葛合剂作用浓度为25 μmol/L时对细胞安全性最好，因此选取25 μmol/L作为淫黄葛合剂作用浓度。前期试验证明，HAMPsiRNA-3序列对HAMP的表达作用干扰最强，故选用HAMPsiRNA-3序列沉默HAMP基因。随机将HT22细胞分为7组：正常组为不处理的完全培养基，Aβ组用Aβ25-35处理，RNAi组用HAMP-siRNA-3干扰，Aβ+RNAi组用Aβ25-35处理后转染HAMP-siRNA-3，Aβ+TCM组用Aβ25-35处理后淫黄葛合剂处理，RNAi+TCM组用HAMP-siRNA-3处理后淫黄葛合剂处理，Aβ+RNAi+TCM组用Aβ25-35处理24 h后HAMP-siRNA-3处理后淫黄葛合剂处理。

1.3 Real-Time PCR检测BACE1的表达

细胞处理后，收集各组处理后的HT22细胞，提取总RNA，反转录扩增。用试剂盒进行实时荧光定量PCR，并进行扩增和检测，用2-△△CT表示待测样品中目标基因的相对表达数量，内参GAPDH、BACE1引物序列见表1。

表1 内参GAPDH、BACE1引物序列

1.4 统计学分析

所有实验数据用SPSS 22.0软件进行分析。数据以均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果与分析

Real-Time PCR结果表明（见图1）：与对照组比较，AD细胞模型组中BACE1表达增加（P＜0.05），给予AD细胞模型组中药后，BACE1表达降低（P＜0.05），说明中药可以通过抑制BACE1的表达，减少淀粉样代谢通路；与RNAi组比较，Aβ+RNAi中的BACE1表达增加（P＜0.05），说明HAMP抑制BACE1的表达；与Aβ+RNAi组比较，Aβ+RNAi+TCM组中的BACE1的表达降低（P＜0.05），说明中药可以使HAMP表达上调，从而减少淀粉样代谢通路的产生。

图1 中药对APP水解HT22细胞BACE1mRNA表达的影响

3 讨论

老年期痴呆的50%～70%为AD的发生[4]，神经系统发生退行性改变，认知、记忆、语言功能发生障碍[5]，使老年人的生活质量大幅度降低，幸福感下降。现在普遍认为联合使用药物治疗、非药物治疗和细心护理能够减轻AD症状和延缓病情发展，尚无特效药能治愈AD或者有效逆转疾病进程[6-8]。

中医辨证论治认为AD病位在脑，根本责之于肾。《黄帝内经》不仅指出“肾主藏精”生理功能，还指出肾精盈亏在脑病发生、发展中的重要地位，提出脑与肾二者之间的关系，强调先天肾精在智力发展中的重要作用[9]。脾胃虚弱亦会致痰湿内蕴，明代《医学正传》中指出津液性质稠黏时则变为痰、饮，停驻过久则和血液相互为用，可随气机上升淤塞脑窍，发为“痴呆”。AD辨证为肾虚精亏，气血不足，痰瘀互结，浊毒内生本虚标实之证[10-11]。根据中医思维治疗AD应强肾补脾、补气养血以培其本，化解痰、祛除瘀、解大毒以治其标[12-13]。遂选取具备强肾补精、生精生髓之功效的淫羊藿作为君药；具备补气健脾、行血化瘀之功效的黄芪作为臣药；具备清热、降火、排毒之功效的葛根作为佐药[14]，提取有效成分制成合剂，既克服了传统中药方剂的缺点，又继承了传统方剂多效性的优点，用现代科学解读中医药作用原理。

AD患者的主要病理学表现为神经炎性斑的出现，Aβ在AD的发病过程中起到至关重要的作用[15-16]，Aβ是其前体蛋白APP经3种不同分泌酶进行分解代谢产生的[17]，其有两条代谢通路，最直观的是APP的淀粉样代谢通路。首先β分泌酶在BACE1位点进行剪切，将sAPPβ蛋白排出胞外，留在胞内的C99片段由γ分泌酶剪切为Aβ多肽。此通路一直被认为是AD发病的中心环节，已成为本病的主要治疗靶点[18]。

BACE1是β分泌酶的一种，其参与APP的水解过程生成Aβ。研究表明，BACE1敲除的小鼠检测不到Aβ[19]。敲除BACE1基因后，Aβ产生显著减少。在抑制BACE1的表达时，AD模型动物的认知功能障碍明显得到改善[20]。

铁是维持正常生理细胞功能所需的重要微量营养素，并参与神经系统中髓鞘和各种神经递质的合成[21]。脑铁含量异常在AD发生病理变化中扮演着重要角色[22-23]。脑铁含量的异常升高促进了AD的发展，进而引发一连串的体内放大机制，并最终导致神经元细胞死亡[24]。

铁稳态的维持只能通过调节铁的吸收来完成，HAMP在维持铁代谢稳定中起着重要作用[25]。调整AD模型小鼠脑组织Aβ的表达形式，其作用机制与调节AD模型小鼠脑组织铁泵蛋白FPN1和铁转运相关蛋白的表达形式关系密切[26]。HAMP基因编码铁调素蛋白，通过结合并促进铁转运蛋白降解，减少细胞表面铁转运蛋白的含量，从而降低血清铁含量，维持细胞内正常的铁元素代谢过程，是重要的调节铁元素的激素[27]。

4 结论

本研究发现，淫黄葛合剂可以通过诱导HAMP的产生，降低脑中铁的含量，抑制BACE1的表达和Aβ的生成，从而改善AD模型小鼠的学习记忆能力。下一步需要对合剂中不同组分、不同剂量的组合分开进行测试，筛选功能成分，优化合剂组方配伍，进一步提高淫黄葛合剂在预防和治疗阿尔茨海默病方面的应用价值。