人血浆中3-甲氧基肾上腺素和3-甲氧基去甲肾上腺素的萃取和浓度检测方法研究

彭婷，范燕华

(1.福建医科大学 免疫治疗研究院，福建福州 350122；2.福州黎明职业技术学院 药学系，福建福州 350109)

嗜铬细胞瘤是一种神经内分泌肿瘤，它会波动性地释放出儿茶酚胺类物质［主要包括肾上腺素（Epinephrine，E）、去甲基肾上腺素（Norepinephrine，NE）等］，儿茶酚胺又进而代谢产生3-甲氧基肾上腺素（Metanephrine，MN）和3-甲氧基去甲肾上腺素（Normetanephrine，NMN）进入血液中，从而引起高血压、器官功能减退、心脑血管疾病，严重时甚至危及生命[1]。因此，越早诊断出是否有嗜铬细胞瘤，就越能阻止病情发展，治愈率就越高[2]。

研究发现，通过检查血浆或尿液中儿茶酚胺类物质（E和NE）的浓度来诊断嗜铬细胞瘤的符合率分别为84%和86%，而检查血浆、尿液中儿茶酚胺的代谢产物MN和NMN的浓度来诊断时，符合率则分别为99%和97%[3-4]。因此，本文主要采用固相萃取法提取人血浆中的MN和NMN，再利用高效液相联合电化学检测器的方法测定MN和NMN的浓度，并对其方法专属性、回收率进行研究[5-6]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器

高效液相色谱系统（包括LC-20AB泵，SIL-20A进样器，CTO-10Asvp柱温箱，DGU-20A3自动脱气装置），日本岛津公司；Waters 2465 电化学检测器，日本岛津公司；色谱柱：Shim-Pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）分析柱，岛津（上海）实验器材有限公司；保护柱：Shim-Pack GVP-ODS（10 L×4.6 mm，P/N 228-34938-91），岛津（上海）实验器材有限公司；XW-80A旋涡混合器，上海精科实业有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；CP114电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司；Waters OASIS WCX Cartridge固相萃取阳离子交换小柱，上海楚定分析仪器有限公司；TGL-18G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；HSC-12A氮吹仪，天津市恒奥科技发展有限公司；HYC-326A型医用冷藏箱，青岛海尔特种电器有限公司；MDF-U53V型医用低温箱，日本三洋电机株式会社。

1.1.2 试剂

3-甲氧基肾上腺素盐酸盐（083M4610V）、3-甲氧基去甲肾上腺素盐酸盐（SHBC4332V）和3,4-二羟基苄胺（MKAA3430V），sigma；甲醇，色谱级，赛默飞；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

进样量：60 μL；流速：1.000 0 mL/min；电化学检测器：显示范围为0～2 nA，池电位0.75 V，过滤时间0.1 s；柱温：30 ℃；流动相配制：取柠檬酸11.00 g、无水乙酸钠4.00 g、EDTA-2Na 0.12 g、1-辛烷磺酸钠0.24 g及氯化钠1.16 g，用无菌注射用水溶解后加入甲醇35.00 mL配制成1 L溶液，抽滤后存放于冰箱保鲜层[7]。

1.2.2 对照品储备液的制备

精密称取偏重亚硫酸钠0.025 g，加入20 mL 0.02 mol/L的HCl，混匀备用（A液）；分别精密称取NE、E、NMN、MN 10.0 mg，用适量A液溶解后加入10 mL的棕色容量瓶中定容得1.00 mg/mL的NE、E、NMN、MN储备液。4 ℃避光保存。

1.2.3 血样前处理及测定

取全血5 mL，10000 r/min离心3 min，取上血浆。取2 mL血浆样品，并用2 mL无菌注射用水稀释，然后装到阳离子交换柱进行固相萃取。分别用2 mL注射用无菌水和1 mL甲醇洗涤并抽干。用4%甲酸甲醇溶液（0.5 mL）洗脱。用氮气将洗脱液吹干，然后用100 μL高氯酸（0.1 mol/L）进行复溶，并在“1.2.1”色谱条件下进样测定[8]。

1.2.4 标准曲线的绘制

配制MN浓度分别为100 pg/mL、200 pg/mL、400 pg/mL、800 pg/mL、1 600 pg/mL 和 3 200 pg/mL，NMN浓度分别为50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、400 pg/mL、800 pg/mL、1 600 pg/mL和 3 200 pg/mL的梯度标准溶液。添加0.05 mL内标溶液3,4-二羟基苄胺（DHBA），同“1.2.2”中血样前处理方法进行处理及测定。横坐标为血浆MN（或血浆NMN）浓度，纵坐标为色谱峰面积与内标物峰面积之比，绘制工作曲线[8]。

1.2.5 回收率

1.2.5.1 提取回收率

以血浆为溶剂，配制含MN和NMN的浓度均为200 pg/mL、800 pg/mL及1 600 pg/mL的溶液各5份，按上述方法萃取后上色谱仪分析，同时取15份空白血浆，以“1.2.2”的方法进行样品前处理，氮气仪吹干，分为3组，每组5份，分别加入同样浓度MN和NMN的标准溶液，在相同条件下进样分析。按照公式（1）计算提取回收率[9]。

1.2.5.2 方法回收率

以血浆为溶剂，配制含MN和NMN的浓度均为200 pg/mL、800 pg/mL及1 600 pg/mL的溶液各5份，萃取后进行高效液相分析，再根据回归方程计算浓度，用公式（2）计算方法回收率[9]。

2 结果与分析

2.1 线性范围

横坐标为血浆MN（或血浆NMN）浓度，纵坐标为峰面积与内标物峰面积之比，作回归方程。MN血浆溶液的线性回归方程：y=0.0029x+0.4002，R2=0.9972，具有较好的线性关系；NMN血浆溶液的线性回归方程：y=0.007 5x+0.244 6，R2=0.999 6，具有较好的线性关系。实验结果说明检测方法准确性较高。

2.2 方法专属性

图1为MN和NMN溶液直接过柱进样的色谱图，MN峰形良好，保留时间为21.579 min；NMN峰形良好，保留时间为15.311 min；图2结果显示，在保留时间21.579 min和15.311 min处，没有其他物质出峰，说明血浆溶剂对MN和NMN的检测不构成干扰。图3结果显示，含MN和NMN血浆中两种物质的保留时间与图1相同，峰形也较好。图4结果显示，NE、E、NMN和MN之间分离良好，也不干扰MN和NMN的测定。

图1 MN和NMN溶液直接过柱进样的色谱图

图2 空白血浆的色谱图

图3 MN和NMN血浆样品过柱进样的色谱图

图4 NE、E、NMN、MN和DHBA混合进样的色谱图

2.3 提取回收率及方法回收率

表1为MN的回收率实验结果，MN的提取回收率分别为82.68%、84.00%和86.35%，平均值为84.34%；方法回收率分别为99.22%、99.55%和98.67%，平均为99.10%。表2显示，NMN的提取回收率分别为86.18%、93.55%和91.92%，平均为90.55%；方法回收率分别为101.58%、99.89%和99.96%，平均为100.48%。由此可见，采用上述实验方法萃取及测定的提取回收率和方法回收率均较高，可满足实际样品测试需求。

表1 MN的回收率

表2 NMN的回收率

3 讨论

3.1 色谱条件优化

研究发现，流动相中甲醇及1-辛烷磺酸钠（离子对色谱试剂）的用量改变会引起NMN和MN的保留时间改变，增加甲醇及1-辛烷磺酸钠的用量，NMN和MN的保留时间延长。经过多次实验发现，1 L溶液中1-辛烷磺酸钠0.24 g，甲醇70 mL为较适宜用量。

3.2 血样前处理方法的优化

本实验最初采用以下方法处理血样：甲醇2 mL冲SPE小柱，水1 mL冲柱；血浆样品2.000 mL，加入0.050 mL内标溶液DHBA混匀，上柱；用2 mL水和1 mL甲醇冲洗并抽干；经4%的甲酸甲醇溶液（0.5 mL）洗脱，将洗脱液进行色谱分析。

这种方法回收率较低，经多次探索后，主要改进了3处：（1）将原方法中活化固相萃取阳离子交换小柱方法改为依次用1 mL甲醇、3 mL水、2 mL甲醇、1 mL水冲柱，这种方式可将柱中残留的杂质完全洗脱且使小柱活化更充分，回收率更为稳定；（2）在上柱前将2 mL血浆样品加灭菌注射用水2 mL稀释后再上柱，可以防止柱子堵塞，并保证血浆中NMN和MN充分与柱子结合；（3）将收集后的洗脱液置于氮吹仪下挥干，用100 μL高氯酸（0.1 mol/L）复溶，经预实验发现挥干甲醇后复溶不影响NMN和MN稳定性，且可提高回收率，加大进样浓度。

此外，预实验发现：（1）过柱前，分别用20 μL、浓度为 2×10-1mol/L、2×10-2mol/L、2×10-3mol/L、2×10-4mol/L和2×10-5mol/L的盐酸溶液调节血浆样品pH值，结果证明血浆样品直接过柱回收率最高；（2）使用500 μL的4%甲酸甲醇溶液可充分洗脱柱子内的NMN和MN；（3）将收集后的洗脱液置于氮吹仪下挥干后，分别用等体积灭菌注射用水、4%甲酸甲醇溶液、0.1%醋酸溶液、0.1 mol/L高氯酸、0.02 mol/L盐酸进行复溶，结果显示0.1 mol/L高氯酸复溶时回收率最高且最稳定。

3.3 血浆样品存储时间的影响

室温放置24 h后样品的测定结果不稳定，采集血样后应及时放入冰盒内送检；如不能及时检测，应将全血离心后，取足量上层血浆置于-80 ℃冰箱内冷冻保存；样品处理后高氯酸复溶室温放置24 h的测定结果也不稳定，可能是由于室温放置时MN和NMN会发生氧化等反应。

4 结论

本研究通过固相萃取-高效液相-电化学检测器联用法测定人血浆中MN和NMN的浓度，得到MN线性方程：y=0.0029x+0.4002(R2=0.9972)；NMN线性回归方程：y=0.0075x+0.2446(R2=0.9996)，具有较好的线性关系。在该实验条件下，MN和NMN峰形良好，保留时间分别为21.579 min和15.311 min，血浆中的内源性杂质及儿茶酚类物质均不干扰测定。MN和NMN的平均提取回收率分别为84.34%和90.55%，平均方法学回收率分别为99.10%和100.48%，均得到较高的回收率。

测定MN和NMN来鉴别与诊断嗜铬细胞瘤相较利用阳离子交换-高效液相色谱-电化学法测定患者的儿茶酚胺（E和NE）阳性率更高[8]，而液相色谱-串联质谱法测定血浆中MN和NMN方式复杂，操作烦琐[7]。本实验建立采用固相萃取人血浆中MN和NMN，用高效液相色谱与电化学检测器联用的方法检测其浓度，方法准确可靠，回收率也较高。

后期将进一步对其进行特异性和敏感性检验等方面的完善，以期为临床嗜铬细胞瘤的检测提供方法学参考。