包装饮用水中铜绿假单胞菌检测方法的比较分析

慕妮，何薛纯，樊青青，胡雨，陈丹丹

（南通市食品药品监督检验中心，江苏南通 226006）

随着我国经济的高速发展，人们的生活节奏逐渐加快，包装饮用水因其方便快捷的特性越来越受到人们的喜欢，其安全性（尤其是微生物指标）受到格外的关注[1],但桶装饮用水微生物项目不合格在日常监督检测中占不合格总数80%以上[2]。《食品安全国家标准包装饮用水》（GB 19298—2014）中规定了铜绿假单胞菌的限量要求为5个包装中均不得检出，但该菌对包装饮用水生产过程中经常使用的臭氧、紫外、二氧化氯等消毒手段有一定的抗性[3-4]，就会导致水中原有的铜绿假单胞菌很难被彻底杀灭，造成产品不合格。另外，企业刚生产的包装饮用水中铜绿假单胞菌含量可能极低，但由于其保质期较长，该菌在运输销售环节中可以增殖至104CFU/mL，也会造成产品不合格[5]。

铜绿假单胞菌又称为绿脓杆菌，是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性条件致病菌，可在水中存活[6-8]。近几年我国多地市均有包装饮用水中检出铜绿假单胞菌的报道[9-12]，其检出率高达25.58%[13]，是导致食物中毒的一种因素[14-15]。铜绿假单胞菌会导致人体出现急性肠道炎、脑膜炎、败血症以及婴儿腹泻等疾病，对抵抗力低下者及婴幼儿具有较大的危害性，同时其耐药性也比较强，因此如何快速而准确地检测出水中铜绿假单胞菌对保障人民饮水安全具有重要的意义。

GB 19298—2014标准中铜绿假单胞菌限量要求为n=5、c=0、m=0，即每批次样品要求检验5个包装且均未检出铜绿假单胞，该批次样品才被判定为合格产品，一旦有可疑的菌落出现便需要作进一步的鉴定工作。随着科学技术的进步，检测铜绿假单胞菌的方法也越来越多，本文通过对几种检测鉴定方法进行比较分析，旨在对铜绿假单胞菌的快速分离及准确鉴定提供参考。

1 铜绿假单胞菌检测方法

1.1 国标法

目前实验室检测水中铜绿假单胞菌主要采用《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016）的传统方法。无菌操作量取250 mL的水样通过孔径0.45 μm的滤膜，后将该滤膜向上贴于CN琼脂平板上36 ℃培养48 h，观察菌落颜色。蓝色或绿色的菌落，进行绿脓菌素确证性试验，该试验为阳性则可判断为铜绿假单胞菌阳性。产荧光（非蓝/绿）和红褐色的菌落要先接种于营养琼脂培养基纯化后进行产氨试验，挑取红褐色菌落的纯培养物进行氧化酶测试和荧光试验。产氨试验为阳性则判断产荧光（非蓝/绿）的菌落为铜绿假单胞菌阳性，而产氨试验、氧化酶试验和荧光试验均为阳性，则判断红褐色菌落为铜绿假单胞菌阳性。其他颜色的菌落则直接判断为非铜绿假单胞菌[16]。

1.2 微生物鉴定系统法

微生物鉴定系统，是一类依据菌种生理生化特性，并结合比色、荧光检测、比浊动态分析等技术手段的半自动化或自动化鉴定系统[17]，目前使用较多的微生物鉴定系统主要有VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统、BD PHOENIX M50全自动微生物鉴定系统、API 20E肠杆菌和其他革兰氏阴性杆菌鉴定系统。该方法前期需要按照国标法通过过滤的手段将细菌富集到CN琼脂平板上，再挑取可疑菌落接种于营养琼脂上进行纯化，培养时间一般为24 h。挑取纯化后的菌落制成适宜浓度的菌悬液，接种于革兰氏阴性鉴定板进行上机分析。

1.3 16S rRNA基因序列分析法

随着分子生物学技术的快速发展，分子生物学基因分型方法不断增多，其中16S rRNA基因测序法从遗传物质和分子水平上对微生物进行鉴定，鉴定技术获得普遍认可，该测序技术应用也越来越广泛[18]。16S rRNA为核糖体RNA的一个亚基，存在保守区和可变区，保守区反映了生物物种间的亲缘关系，可变区体现物种间的特异性。在利用16S rRNA基因序列分析法进行鉴定时，需要利用滤膜上富集的特征或可疑菌落接种于营养琼脂上，再挑取营养琼脂上的单个菌落接种到液体培养基中，36 ℃培养18 h后提取DNA，进行PCR扩增及电泳检测，然后测定序列，并对16S rRNA基因序列进行分析与构建系统发育树[19]，从而对细菌进行鉴定。

1.4 LAMP检测法

环介导等温扩增技术（Loop-meditated Isothermal Amplification，LAMP）是一种通过优化改良的等温基因扩增方法[20]，该技术核心在于设计一组具有4个以上特异性的引物，在Bst DNA聚合酶的作用下，在65 ℃左右的恒温条件下，在1 h内完成相应的聚合酶链式反应，来识别目的基因的6个特定区域[21-22]。LAMP检测法鉴定包装饮用水中的铜绿假单胞菌：首先，将富集在CN琼脂平板上的菌落接种于营养肉汤中进行纯化；其次，提取细菌基因组DNA，针对铜绿假单胞菌的基因序列设计合成引物；最后，按照LAMP扩增条件进行扩增，扩增产物可以通过浊度法、荧光检测法或琼脂糖凝胶电泳法鉴定[23]。

1.5 酶底物法

铜绿假单胞菌利用Pseudalert中丰富的氨基酸、维生素以及其他营养物质快速生长和增殖，而且产生一种水解酶，底物经酶水解后在366 nm紫外灯下产生蓝色的荧光，以此对铜绿假单胞菌进行鉴定[24]。该技术不需要用纯的细菌培养物进行试验，只需将包装饮用水样品直接与含酶底物Pseudalert试剂的稀释液充分混匀后，倒入97孔无菌定量盘内；用封口机封口后置于36 ℃培养箱中培养24 h；在暗处用波长为366 nm的紫外灯照射定量盘，有黄色反应且有蓝色荧光反应的空穴则表示有铜绿假单胞菌。然后可对照《97孔定量盘法不同阳性结果的最可能数MPN及95%可信范围》表查出其最可能数，结果以MPN/100 mL表示，达到快速定量的目的[25]。

1.6 MALDI-TOF MS法

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOF MS）是一种将质荷比不同的运动离子（如带电荷的核酸、蛋白质等）通过电场和/或磁场，加速通过飞行管道后，根据达到检测器的时间及离子数量而形成相应的峰图的检测方法。微生物是由不同的特异蛋白质组成，不同的蛋白质通过MALDI-TOF MS会获得种属间的特异峰图，将其与标准数据库中的参考图谱进行比对，得到最为匹配的几种菌种并给出相应的鉴定分数，进而得到最终的鉴定结果[26]。同样，MALDI-TOF MS法鉴定包装饮用水中的铜绿假单胞菌也需要将水样过滤富集到CN琼脂上，将可疑菌落接种到营养琼脂上做进一步纯化，挑取纯菌落进行处理制成上清液，吸去上清液点样到96孔靶上后进行质谱鉴定。

上述6中检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的方法特点见表1。

表1 6种检验方法特点对比

2 讨论

GB 8538—2016中关于铜绿假单胞菌的检测方法是目前基层食品检验检测机构鉴定铜绿假单胞菌的首选方法，国标法操作简单，对试验人员要求较低，比较适合硬件条件较差的小型企业和检验机构，但不能实现大批量样本的快速检验；另外，判断菌落颜色存在个人主观差异，容易造成误判，试验结果准确性相对较低，经常会出现假阳性或假阴性的结果[27]。当滤膜上的菌落小于50 CFU时，计数结果较为理想；当滤膜上的菌落达到100 CFU时，计数的准确性将大大降低；另外在CN琼脂上培养24～48 h的条件使得无法对该菌进行准确计数[28]。

微生物鉴定系统法与国标法相比具有准确性高（可高达98%[29]）的优势，目前已在微生物检验领域得到广泛应用。但检测过程中用于鉴定的菌悬液的纯度、浓度、培养时间、培养基类型以及传代次数等因素会对检验结果有较大的影响，对前期准备阶段人工操作的要求较高，且仪器和耗材昂贵，因此对条件一般的实验室不太适合，适合中型规模及以上企业和基础条件较好的检验机构。利用国标法和微生物鉴定系统法鉴定铜绿假单胞菌可能会受到荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌的干扰，有可能造成错判，而其中的API 20E对该菌的鉴定相对准确和可靠，但也会出现较高的氧化酶假阳性的情况[30]。

16S rRNA基因序列分析法特异性很强，可以鉴定到种，该方法和LAMP检测法都是从基因层面上测定铜绿假单胞菌，操作简单、准确率更高，但这2种方法试剂昂贵，对检验人员的分子生物学水平有一定的要求。16S rRNA基因序列分析法需要通过烦琐的变温程序进行检测，而LAMP检测法只需恒温反应进行检测，被认为是一种可行的、经济有效的分子诊断替代手段，且有实验证明LAMP法的灵敏度比16S rRNA基因序列分析法提高了约9倍[31]。这两种方法比较适合用于基础条件好的检验机构和科研单位。

酶底物法是根据铜绿假单胞菌的特异性酶和特异性底物反应，通过计数定量盘荧光孔阳性数作为检测结果的判断依据。酶底物法不需要分离纯化单菌落，该技术在24 h内即可得到结果，无需进行验证试验，与国标法的检验结果无显著性差异[32]，对实验室及设备的要求低，适于应对突发公共卫生事件，但该方法试验耗材成本较高。酶底物法最重要的一点是可直接定量，可以作为检测包装饮用水中的铜绿假单胞菌含量的替代方法，在国外有些国家已批准作为检测铜绿假单胞菌的标准方法，比较适合用于生产量较大的大型生产企业及应对突发公共卫生事件的检验单位。

MALDI-TOF MS方法检测包装饮用水中的铜绿假单胞菌检出限低，菌液只需到达104CFU就可以检测。该方法鉴定铜绿假单胞菌从纯菌落处理到仪器鉴定仅需要0.5 h左右的时间，鉴定一般常见的病原菌准确率可达95%以上[33]。但前期仪器投入成本较大，细菌因生长环境差异发生变异或导致基因表达发生改变，会出现不同地区同种菌株的蛋白质指纹图谱之间存在差异，因此商业数据库会存在某方面的缺陷，需要不断更新完善。实验室可根据本区域检出的铜绿假单胞菌建立补充数据库，弥补该类缺陷，以得到匹配分值更高的结果。同时，该方法具有高通量的特点，可满足检测更大量样品是的通量需求，但使用该方法产生的结果会受到仪器状态、样品处理方法、基质以及一些人为因素的直接影响。另外，可以将MALDI-TOF MS方法应用到检测铜绿假单胞菌的细菌耐药性及药敏分析方面[34]，比较适用于科研单位、医院及应对突发公共事件的检验单位。

3 结语

上述方法从生化水平、基因序列、蛋白指纹图谱等不同维度分析鉴定铜绿假单胞菌，均有其优势性和局限性。对于一般实验室，除了考虑鉴定方法的准确性、重现性还需要考虑仪器设备的使用率和成本以及年均样品量等。根据实验室自身实际情况，铜绿假单胞菌的鉴定可以在采用 GB 8538—2016方法的基础上结合全自动细菌鉴定系统、16S rRNA基因序列分析法、酶底物法以及MALDI-TOF MS法，相互佐证，提高准确率，减少误判。