人参皂苷对肺癌细胞增殖、凋亡影响及作用机制

张宇辰， 沈继春， 曲雅静， 徐朋朋

武警特色医学中心 1.肿瘤科；2.内分泌与血液科，天津 300162

肺癌是目前全世界发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命健康[1]。在我国，肺癌的发病率及死亡率也居于恶性肿瘤首位[2]，很多患者在发现时已经处于晚期，错过了最佳治疗时机，无法进行手术治疗，常规放疗和化疗效果也不佳，导致5年生存率低。肺癌细胞的无限增殖、转移及对化疗药物的耐药是影响治疗效果和患者生存率的重要因素。近年来，随着诊断和检测水平的不断提高，肺癌的发病机制在分子水平研究不断加深，关键的信号调控通路异常与肺癌的发生具有密切关系已被证实。Keap1/Nrf2信号通路是一条重要的抗氧化保护性通路，主要包括Keap1、Nrf2及抗氧化反应原件ARE[3]。有研究表明，人类肺癌组织中存在Keap1、Nrf2/ARE基因突变[4]，导致肺癌Keap1-Nrf2/ARE通路活化，参与肺癌的生物学行为，包括减少癌细胞凋亡、促进癌细胞增殖、介导癌细胞耐药等[5]。人参皂苷是人参的主要活性成分，具有抗炎、抗过敏、抗衰老、保护神经等药理作用[6-8]。有学者发现，人参皂苷可以减少癌细胞增殖并促进其凋亡，抑制癌细胞血管生成[9-11]。本研究旨在探讨人参皂苷Rg3对非小细胞肺癌细胞系NCI-H292细胞增殖、凋亡的作用及其与相关信号通路Keap1-Nrf2/ARE的关系。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 非小细胞肺癌细胞系NCI-H292购自中国科学院细胞细胞库；人参皂苷Rg3购自上海叶源生物公司；胎牛血清、RPMI1640细胞培养液购自美国Gibco公司；青霉素链霉素双抗、PBS胰蛋白酶购自Hyclone公司；CCK8增殖试剂盒购自上海贝博生物技术公司；活性氧检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；基因引物由上海生工科技有限公司合成；TH4-200型荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)，流式细胞仪(美国Beckman Coulter Altra公司)。

1.2 细胞培养 将细胞置于含有10%胎牛血清的RPM11640培养液进行培养，定期更换培养液，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内，待细胞长满瓶底面积80%，加入胰酶消化并传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 CCK-8增殖 取生长对数期的细胞，以2×104每孔的细胞数接种于96孔板中，置于37 ℃温箱中培养，设立对照组(人参皂苷组0 μmol/L)、人参皂苷组(20、40、60 μmol/L)，培养24 h后，按以下公式计算细胞倍增时间(doubling time，DT)。每孔加入20 μl的CCK-8溶液，避光孵育30 min。采用酶标仪在450 nm波长下测定各个孔的吸光度，检测增殖能力。

DT=细胞培养时间×log2/log(最终细胞数量/初始细胞数量)

1.4 细胞凋亡能力 取生长对数期的细胞，加入人参皂苷Rg3(0、20、40、60 μmol/L)作用24 h后，PBS洗涤细胞3次后胰酶消化并收集细胞，离心后弃去上清，加入5 μl的Annexin V-FITC染液，混匀后再加入10 μl的碘化丙啶染色，混匀。37 ℃下静置4 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.5 反转录聚合酶链反应检测相关mRNA表达 取生长对数期的细胞，加入人参皂苷Rg3(0、20、40、60 μmol/L)作用24 h后，按照试剂盒说明进行RNA提取并逆转录为cDNA，实时反转录聚合酶链反应测定Keap1、Nrf2的表达量。Keap1：上游3’-TTCAAGCCGCAGTTGCTCA-5’，下游3’-TTAGTCACCAGCGGGACG-5’。Nrf2：上游3’-GACTCTACCACTGTTCCCAA-5’，下游3’-CCATTCTTATTTCACCGACG-5’。Beta-actin：上游3’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-5’，下游3’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-5’。

1.6 Western blot检测相关蛋白表达 取生长对数期的细胞，加入人参皂苷Rg3(0、20、40、60 μmol/L)作用24 h后，加入细胞裂解液，利用超声破碎仪进行破碎，在12 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，取上清，每孔20 μg蛋白样品量上样。SDS-PAGE电泳进行蛋白分离，再转移蛋白至PVDF膜上，5%胎牛血清封闭2 h，caspase-3、Bcl-2、Beta-actin抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次后加入荧光二抗孵育2 h。采用UVI凝胶成像分析系统测量条带光密度；以Beta-actin为内参，以目的蛋白和内参蛋白的光密度比值为目的蛋白的相对表达量。

1.7 活性氧水平检测 取生长对数期的细胞，加入人参皂苷Rg3(0、20、40、60 μmol/L)作用24 h后，每组收集1×106个细胞，洗涤后重悬于PBS中，加入10 mmol/L的DCFH-DA，使细胞终浓度为1 μmol/L，37 ℃避光温育20 min，PBS洗涤后重悬，流式细胞仪检测荧光强度。

1.8 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行处理。计量资料组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂苷Rg3对NCI-H292细胞增殖影响 与对照组比较，随着人参皂苷Rg3浓度增加，细胞增殖能力下降，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见图1。

图1 人参皂苷Rg3对NCI-H292细胞增殖影响 图2 人参皂苷Rg3对NCI-H292细胞凋亡影响

2.2 人参皂苷Rg3对NCI-H292细胞凋亡影响 与对照组比较，随着人参皂苷Rg3浓度增加，细胞凋亡能力上升，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见图2。

2.3 人参皂苷Rg3对caspase-3和Bcl-2蛋白表达量影响 与对照组比较，随着人参皂苷Rg3浓度增加，caspase-3和Bcl-2蛋白表达量上升，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见图3。

图3 人参皂苷Rg3对caspase-3和Bcl-2蛋白表达量影响

2.4 人参皂苷Rg3对Keap1 mRNA和Nrf2 mRNA影响 与对照组比较，随着人参皂苷Rg3浓度增加，Keap1 mRNA表达上升，Nrf2 mRNA表达下降，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见图4。

图4 人参皂苷Rg3对Keap1 mRNA和Nrf2 mRNA影响 图5 人参皂苷Rg3对细胞内氧化应激水平影响

2.5 人参皂苷Rg3对细胞内氧化应激水平影响 与对照组比较，随着人参皂苷Rg3浓度增加，活性氧水平上升，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见图5。

3 讨论

根据我国癌症中心统计，2015年，我国有73.3万例肺癌新发病例，死亡病例达到61.0万，严重威胁人类健康[12]。肺癌患者预后不良、生存率低与患者多在晚期发现、肿瘤组织对化疗药物耐药等密切相关[13]。因此，深入探讨肺癌细胞的增殖、凋亡、耐药机制对于肺癌的的诊断、治疗及新型靶向药物的研究具有重要意义。

人参是我国传统中药成分之一，其主要活性成分为人参皂苷。人参皂苷Rg3具有抑制肺癌细胞血管生成的作用，主要机制是通过降低血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9等血管新生诱导因子表达抑制癌细胞血管生成[14-15]。人参皂苷还可以降低多药耐药基因、P糖蛋白的表达，提高其对化疗药物的敏感性[16-17]。

细胞凋亡途径分为受体介导的细胞凋亡途径及线粒体介导的细胞凋亡途径，Bcl-2和caspase-3是线粒体介导的细胞凋亡途径中的两种调节蛋白。Bcl-2家族的两种促凋亡蛋白Bax和Bak可使线粒体外膜通透化，导致下游caspase-3以及核酸酶等被活化，随之维持细胞生存的蛋白质和核酸被降解，细胞凋亡发生。Keap1-Nrf2/ARE信号通路是一条机体抗氧化应激及活性氧物质的重要通路。Nrf2是细胞内调节氧化应激的主要转录因子，存在于肝、肾、消化道、皮肤、肺[18]。Keap1属于Kelch家族多区域阻遏蛋白，位于19p13.2位点，是Nrf2的关键负调节因子[19]。ARE是一个DNA启动子结合序列，Nrf2可以激活该启动子序列，当ARE序列被激活时，受ARE调控的相关基因开始转录并诱导靶基因表达，包括代谢、细胞内氧化还原平衡、凋亡及自噬，从而发挥保护作用[20]。有研究表明，Nrf2过表达和Keap1表达缺失在非小细胞肺癌患者中十分常见，且与临床不良预后、对顺铂耐药等密切相关[21]。癌细胞会产生大量活性氧，过量活性氧会导致细胞核氧化损伤，Nrf2可以减少氧化应激，从而减少细胞凋亡，当Keap1表达缺失时，Nrf2过表达，导致癌细胞抗氧化应激能力增强，凋亡减少[5]。此外，Nrf2可调节成纤维细胞生长因子-13、转化生长因子-β1、转化生长因子-β2等生长因子，因此，当Nrf2过表达时，还可促进癌细胞增殖[22-23]。某些类型肺癌患者存在Keap1突变，导致其蛋白终止密码子提早出现，引起氨基酸种类和数量改变，最终导致Keap1功能缺失，丧失了对Nrf2的负性调控，促进了肿瘤的发生发展[24]。

本研究结果发现：人参皂苷Rg3可抑制NCI-H292增殖，促进NCI-H292凋亡，且作用呈浓度依赖性；人参皂苷Rg3还会使细胞内抗氧化机制减弱，出现活性氧蓄积；上述改变可能与Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关。

综上所述，人参皂苷Rg3可能通过抑制Keap1-Nrf2/ARE信号通路而抑制非小细胞肺癌细胞增殖，并促进其凋亡。