邯郸某鸡场禽源空肠弯曲菌的分离鉴定与耐药性情况

李晶晶，刘彦威，刘建钗

（河北工程大学，河北邯郸 056000）

随着养殖业的迅速发展， 禽类疾病的种类越发复杂，且不同疾病的症状与病变的相似之处越来越多， 临床上准确诊断出疾病愈发困难，传统的诊断方法不能准确诊断出疾病，所以怎样对病鸡做出最准确的诊断就显得尤为重要，而细菌的分离鉴定就能做到准确诊断疾病。

细菌性的疾病， 虽然有与之相符的抗生素对其进行抑制，但是现在存在着很多问题。 现在面临的问题是很多的细菌已经对一些常用的抗生素产生耐药性，并且这种耐药性还可以通过这种菌上的耐药基因进行一代代的传递，这会对疾病的治疗产生很大的影响，使此类疾病的病程延长，治疗成本加大，产生更大的损失。并且细菌产生耐药性会使大多数常用的抗生素对此病菌效果不显著甚至无效，所以细菌分离鉴定后的药敏试验可以有效地指导临床用药，让疾病得到最为高效的治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药敏试验质控菌株（大肠杆菌25922、空肠弯曲菌NCTC11168） 为河北工程大学兽医实验研究所保存。

1.1.2 培养基和试剂 改良CCD琼脂培养基、Cary-Blair 氏运送培养基、 改良CCD 琼脂添加剂、 布氏肉汤、Bolton 肉汤、脱纤维羊血、MH（A）培养基，青岛海博生物技术有限公司产品； 微需氧厌氧袋，日本三菱公司；TAE 缓冲液，康为世纪生物科技有限公司产品；载玻片，秦皇岛市东风医用玻璃厂产品； 草酸铵结晶紫染液产品、 革兰氏碘液、90%乙醇、番红染液，常德比克曼生物科技有限公司产品；琼脂糖，西班牙Agarose 产品；甘油，天津欧博凯化工有限公司产品。

1.1.3 药敏试纸 药敏纸片，上海源叶

1.1.4 主要仪器 摩尔基因超纯水器， 德国Millipore 公司； 立式自动电压力蒸汽灭菌器，合肥华泰医疗设备有限公司； 电子显微镜， 日本Olympus 公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；数控恒温水浴锅，常州易晨仪器制造有限公司；台式高速旋转离心机，德国Eppendorf 公 司 ；Bio-Rad 凝胶成像分析系统，上海勤翔科学仪器有限公司；隔水式电热恒温培养箱，上海龙跃仪器设备有限公司；2.5升密封培养罐，日本三菱公司。

1.2 试验方法

1.2.1 空肠弯曲菌的分离 接种环沾取少量泄殖腔拭子， 在改良mCCDA 培养基划线分离，并将培养板放入厌氧培养袋或培养罐中，放入微需氧产气袋密封， 42℃温箱内培养48 小时后看结果。 对疑似菌落，呈扁平状或透明水滴样再进行增菌划线培养。

1.2.2 空肠弯曲菌的鉴定 对有明显空肠弯曲菌的菌落形态，进行革兰氏染色并在显微镜下观察，并采用水煮法提取DNA，通过空肠弯曲菌hipO 基因鉴定。 引物序列见表1。

表1 引物序列基因

PCR 反应体系为25 微升：2×Taq PCR Master Mix 12.5 微升，hipO 基因上下游引物各1 微升，DNA 模板2 微升，ddH2O 补齐25 微升。

PCR 反应程序为95℃5 分钟；95℃30 秒，60℃30 秒，72℃1 分钟，72℃，7 分钟。 PCR 产物在1%的琼脂糖电泳， 凝胶成像系统下观察结果，并采集图像。

1.2.3 空肠弯曲菌K - B 纸片法药敏试验

对采样分离所得的禽空肠弯曲菌分离株，运用K-B 纸片法进行药物敏感性试验， 根据对公共卫生的影响和临床重要性，选择使用氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹诺酮类、β-内酰胺类、林可酰胺类六类6 种抗生素药敏纸片进行药敏验证。将贴好药敏片的平板倒置与厌氧袋一起放于厌氧罐中，42℃厌氧培养48 小时后，测量抑菌圈直径， 并以大肠杆菌25922 作为质控株，根据CLSI 发布的标准判断样本菌株对各药物敏感（S）或耐药（R）。

药敏片详细信息参考表2

表2 药敏片及判定标准

2 结果与分析

2.1 空肠弯曲菌分离与鉴定

空肠弯曲菌在mCCDA 培养基上呈灰色、湿润、凸起光滑的水滴样菌落，非常小，比大肠杆菌小一些(如图1)；革兰氏染色，呈弧形、S 型弯曲状(如图2)； 经过扩增特异性hipO 基因后，1×琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物片段，大小基本相同，条带一致，并处在预期序列大小范围内（目标片段735bp）（见图3）。 结果显示，从邯郸某养鸡场采集的150 份鸡泄殖腔拭子， 共分离出14 株空肠弯曲菌分离菌。

图1 菌落形态鉴定

图2 革兰氏染色

图3 分离株普通PCR 鉴定

2.2 空肠弯曲菌分离株的耐药情况

KB 纸片法检测结果表明，14 株分离菌对六种抗生素耐药情况最高的是红霉素， 其次是环丙沙星（见图4）。

图4 耐药情况

3 讨论

空肠弯曲菌广泛存在于多种畜禽、 野鸟等动物肠道内。 本试验主要是从蛋鸡禽泄殖腔拭子分离培养空肠弯曲菌，培养过程中，需要的条件比较苛刻，需要较低含量的氧气，不像大肠杆菌在正常空气中37℃就能长的很好， 空肠弯曲菌长时间暴露在空气中也会导致其死亡，本身培养所用的培养基成本也比较高，在这种情况下，如何快速划线培养及鉴定就成为了成功分离空肠弯曲菌的关键，从流行病学来说具有深远的价值意义。

弯曲菌对大多数抗生素敏感， 弯曲菌种类的分化可能有助于选择适当的抗生素治疗。 尤其像空肠弯曲菌对氟喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类和β-内酰胺类表现出不同程度的耐药，耐药趋势的发展已经引起世界各国的广泛关注。 人类临床上最常用的治疗药物是大环内酯类如红霉素和氟喹诺酮类如环丙沙星，从本次药敏试验结果也能得到红霉素有明显耐药情况。

4 小结

检测空肠弯曲菌的方法很多，各有利弊，建立一个更快速简便、更稳定可靠、更高效准确、更低成本的检测技术是保证公共卫生和食品安全的迫切需求。 可以预见，多种检测技术的有机结合和优势互补有望解决上述需求。