腧穴启动机制研究进展

朱怡，李毅，东贵荣

上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院针灸科，上海 200437

针灸是数千年传统医学文化的重要组成部分，其疗效已被大量临床及基础证据证实，而腧穴作为针灸学的核心内容之一，许多科学问题尚未被阐明。针灸临床实践和基础研究证实了针刺主要通过腧穴对相应脏腑乃至整体进行调节，腧穴是治疗的关键，适宜的刺激能够启动腧穴从而治疗相应脏腑乃至全身疾病。但腧穴如何启动，如何将针刺信息进行整合传导和级联放大以作用于相关脏腑乃至整体仍是需要深入探索的内容。生物体是一个复杂的网络系统，现代针灸学对于腧穴作用机制的研究更接近于生物学本质，从腧穴刺激到机体效应，二者不是直线联系的，腧穴对脏腑的调节作用是通过神经节段或神经-内分泌-免疫这个复杂的网络系统实现的[1-2]。针灸刺激是一种物理性刺激，直接作用于腧穴，腧穴将此物理信号转化为生物学信号，从而通过神经节段或神经-内分泌-免疫网络系统发挥效应。因此，腧穴如何将针刺刺激这一物理刺激转化为生物学信号是腧穴作用启动的关键。现代针灸学对腧穴启动的研究相对较少，为此，笔者通过查阅文献，对近10年来腧穴启动效应机制的研究进行了系统性的回顾，以期进一步为针刺腧穴启动机制的研究提供借鉴和思路。

1 腧穴启动的涵义

腧穴启动是腧穴接受刺激，并将刺激转化为生物学信号的过程，涉及腧穴局部微循环、神经细胞、结缔组织和肥大细胞等的相互作用。腧穴启动是针灸发挥作用的关键，也是所有腧穴起效的共有过程之一。只有腧穴被启动，刺激才能通过一系列级联放大效应，发挥调整相应脏腑功能的效应。但腧穴如何才能被启动，什么样的刺激能够启动腧穴，腧穴启动是否与相应生理病理状态相关，都是需要深入探索的内容。

2 腧穴“敏化特性”是腧穴启动的基础

从腧穴的起源发展可知，古人对腧穴“敏化特性”其实早有认知。他们对腧穴的认识从最初采用砭石等针具进行割痈排脓，逐渐发展到以痛为腧的模式，如“阿是穴”。随着对疾病及腧穴认识的发展及不断总结，进而发展为具有治疗特定疾病或相同治疗作用的“经穴”等。《灵枢·九针十二原》提出可通过观察相关腧穴来诊断相应脏腑疾病：“五脏有疾也，应出十二原，而原各有所出，明知其原，睹其应，而知五脏之害矣。”说明脏腑疾病，在体外必有相应的反应点，这种变化的位置与现代医学反射性牵涉痛的位置几乎相同，如《素问·藏气法时论》所载：“心病者，胸中痛，胁支满，胁下痛，膺背肩胛间痛，两臂内痛”。1895年，Mackenzie首次系统描绘了心源性牵涉痛出现在体表的部位，心肌缺血或心绞痛时，心前区、左肩和左上肢内侧与尺侧体表出现牵涉痛，这与经络体系的心包经和心经的循行路线几乎完全重叠，对心肌缺血等心脏疾病有明显改善作用的“内关”穴就是位于该反射区。现代研究也证实了心脏发生缺血性病变时，心脏感觉传入神经C8-T5节段支配的区域会发生牵涉性的“敏化”反应[3-4]。当靶器官出现病变，相应体表部位出现牵涉性或其他特殊变化的特征，我们将其称之为“穴位敏化”现象。因此，现代研究从另一个角度阐述了腧穴的特性——穴敏性，即腧穴不是静态的，而是动态的，腧穴在生理状态下不具备功能性，只有在相应脏腑出现疾病的病理状态下，腧穴才显现出特有的功能性[5-6]。此时，适当的刺激能够启动腧穴，激活相关作用机制，从而治疗相应脏腑的疾病。因此，这种敏化特性是腧穴启动的基础，只有当靶器官出现病变时，腧穴才会被感知和激活，这时的腧穴就像一个“触发器”，针刺刺激就是激活“触发器”的开关，从而启动腧穴发挥调节作用[7]。Fan等[8]研究发现，在大鼠固定性诱导高血压后1 min内，腧穴局部出现神经源性炎症，在15 min内达到顶峰，并在主动脉壁间血肿期间维持，提示腧穴的局部改变先于病理状态的发生，并在病理状态下维持。神经源性炎症反应为腧穴敏化状态提供了科学根据[9-10]。

现代针灸学对穴位敏化的研究包括痛敏、电敏、光敏、热敏和化学敏等。痛敏是指病变脏腑相应腧穴部位对疼痛的敏感性增加[11-12]；电敏是指病变脏腑相应腧穴局部皮肤电位或电传导特性的改变[13]；光敏表现为病理状态下腧穴发光强度的改变[14]；热敏则是病理状态下相应腧穴局部皮肤温度发生改变[15]；化学敏表现为病变脏腑相应腧穴局部组织生化改变，主要是神经元激活或生物化学改变等[16-17]，但不论哪种敏化方式，都需要通过适当的刺激来启动腧穴，才能发挥腧穴治疗效应。其中，炎症反应作为敏化特性之一，在腧穴信息启动中发挥着重要的作用[18]。

3 腧穴局部局限性的炎性反应是腧穴启动的关键因素之一

炎性反应是由于微生物感染、组织损伤等，导致炎性细胞浸润为特征的反应。早在40年前，研究者就认为腧穴局部是一个自生性炎性反应区[19]。针刺刺激作为一种轻微程度的损伤性刺激，可在局部形成小范围的炎性反应[20]。穴区局部组织损伤、变性，出现充血和水肿，腧穴局部免疫细胞募集，炎性信号通路激活，导致腧穴局部炎症因子表达增高，但不会引发全身性的炎症反应，这种局限性的炎性反应可能是腧穴启动的关键因素之一。

3.1 针刺后腧穴局部免疫细胞募集针刺腧穴后，局部免疫细胞进行募集，其中最主要的免疫细胞包括肥大细胞、单核巨噬细胞、成纤维细胞及中性粒细胞等[21-22]。

肥大细胞是人体重要的免疫细胞之一，可以对细菌、病毒及机械刺激等多种理化刺激做出反应，迅速释放颗粒中的递质，同时释放快速合成脂质递质，最后释放新合成的细胞因子和驱化因子[23]。当机体受到机械性刺激时，这种刺激通过细胞外基质传递，并经黏附因子传递到细胞骨架，最终引起细胞效应[24-25]。1977年，研究者首次提出肥大细胞与经穴现象具有一定的相关性[26]。在病理状态下，脏腑相应腧穴发生敏化，肥大细胞聚集，通过适宜针刺刺激，可以激活肥大细胞，促使肥大细胞脱颗粒，释放组胺等炎性递质，引起神经、免疫细胞等的一系列反应。肥大细胞是目前公认的与针刺信息传导密切相关的移动细胞，在针刺后局部的信息启动和传导中发挥了重要作用。例如，有学者利用计算机辅助方法对腧穴组织平均肥大细胞脱颗粒率进行计算，发现针刺急性佐剂关节炎大鼠足三里穴后，腧穴局部肥大细胞脱颗粒率明显升高[27]；针刺大鼠合谷穴后，穴区局部出现肥大细胞沿血管和神经募集，并伴有脱颗粒现象[28]；针刺大鼠足三里穴后，腧穴局部5-羟色胺免疫阳性肥大细胞数量增多，皮下和真皮层中肥大细胞多于横纹肌中，并且发生脱颗粒[29]。因此，肥大细胞被认为是针刺腧穴启动的关键因素之一。

巨噬细胞是参与人体免疫反应重要的免疫细胞，是来源于造血干细胞的具有杀伤和修复双重功能的高度可塑性分化细胞，能够在几乎所有的器官中表达，在不同因素的刺激下产生不同亚型，在组织损伤、修复和炎症反应的病理生理过程中发挥重要作用。目前，已有研究证实了针刺后腧穴局部皮下巨噬细胞增多[30-31]。Xu等[32]运用多时点、多位点、高通量检测神经内分泌免疫网络共有信号分子的多维数据及复杂网络分析，计算分析出巨噬细胞是针刺效应的关键细胞。Zhang等[21]针刺佐剂关节炎大鼠足三里穴后发现，穴区局部大量免疫细胞募集，其中主要的免疫细胞是巨噬细胞、成纤维细胞、CD4+T细胞和中性粒细胞。

成纤维细胞也是参与局部免疫反应的关键细胞[33-34]，针刺后腧穴局部成纤维细胞表达增高[35]。成纤维细胞与人体的筋膜系统密切相关，是筋膜的主要组成部分，筋膜结缔组织受刺激时，会使成纤维细胞转化数量增加，增强对组织损伤修复的能力[36-37]。人体筋膜组织是自主神经系统通过调控交感神经和副交感神经的平衡为人体功能系统的活动提供一个稳定的内环境[38]。人体筋膜系统与中医经络腧穴系统密切相关，腧穴的解剖结构中也包含了筋膜组织，筋膜上含有大量的神经感受器和细胞，当受到针刺刺激时会牵动相应范围的筋膜结构，产生生物学信息[39]。研究表明，皮肤成纤维细胞细胞外信号调节激酶的激活是诱导针刺镇痛的关键因素，当针刺腧穴时，提插捻转，腧穴局部组织内的胶原蛋白纤维会激活结缔组织中的成纤维细胞，纤维细胞质中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)降解产生的腺苷是介导针刺镇痛的主要因素之一[40]。随着现代医学的发展，在超声等其他测量技术的支持下，可进一步探讨针刺激如何启动激活成纤维细胞，如何将信号传导，涉及哪些信号通路等，为探索针刺启动的效应机制提供新方向。

除此之外，CD4+T细胞和中性粒细胞也参与了针刺后穴区局部免疫反应。这些免疫细胞可能相互作用或促进，进一步激活其他分子和细胞功能，将针刺信息放大，触发针刺的特异性及整体调控作用。但值得注意的是，针刺腧穴后，虽然免疫细胞发生募集，激活局部免疫反应，但这种免疫反应不是无限扩大的，在针刺后期，穴区局部免疫反应逐渐减弱，发挥出保护穴位局部组织的作用[21]，这种表现符合腧穴的特性，也为今后的研究提供了方向。

3.2 针刺后腧穴局部炎性信号通路激活通过前期研究可知，针刺腧穴后，腧穴局部形成小范围的炎症反应，炎性细胞聚集，但介导炎症反应的相关信号通路是否被激活需要进一步明确。由于针刺刺激，腧穴局部组织细胞轻微受损，损伤的细胞释放出危险信号物质，可称之为损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，DAMPs能与腧穴局部募集的巨噬细胞、成纤维细胞等表面的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)结合，其中PRR包括Toll样受体(toll-like receptor，TLR)、核苷酸寡聚化结构域NOD样受体(nucleotide oligomerization domain-like receptor，NLR)等，从而激活相关信号通路，产生一系列炎症介质，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-β(interleukin-β，IL-β)和 IL-18等，导致炎症反应的发生[41]。

本课题组前期通过对脑出血大鼠模型进行针刺风府穴预处理治疗，应用 RNA-seq 技术对穴区组织进行基因检测发现，针刺后穴区局部的差异表达基因有4 857个，其中上调2倍以上者2 088个，下调2倍以上者2 877个。通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)与信号通路的关系，筛选出与针刺关系密切的通路主要有：IgE 高亲和力受体(high-affinity IgE receptor Fc epsilon I type receptor，FcεRI)信号通路、TLR信号通路、破骨细胞的分化、细胞黏附分子、趋化因子信号通路等。赵雪等[42]对佐剂关节炎大鼠足三里穴进行针刺，通过基因芯片技术分析了腧穴局部相关基因及信号通路，发现以免疫系统相关基因最多，信号通路以炎性反应相关信号通路为主，包括TLR信号通路、NOD样受体信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，同时通过对差异基因信号通路数据库进行检索发现，炎性反应相关信号通路下游均通过核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)介导炎性反应，并且针刺后与NF-κB信号通路相关的髓样分化因子-88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)表达亦增加。这项研究与我们前期研究内关穴对心肌缺血再灌注损伤大鼠内关穴局部TLR4/MyD88/NF-κB表达的影响结果一致[43]。并且目前已有文献显示，针刺腧穴后，穴区局部产生的高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)和TLR4结合，可通过激活TLR4介导的炎症信号通路，使穴位局部产生炎症反应，针刺可激活穴位局部HMGB1-TLR2/TLR4-NF-κB通路，腧穴局部注射NF-κB抑制剂后，针刺镇痛效应下降。以上研究均说明，针刺后穴区NF-κB通路可能是针刺信息启动传导的关键通路[44-45]。

目前，NOD样受体中以NLRP3炎症小体研究最为广泛，NLRP3炎症小体由 NLRP3、接头蛋白-凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和炎症前体蛋白procaspase-1组成，能识别 DAMPs 中的 TLRs 和 NLRs，使 TLR4/NF-κB 信号通路表达上调，NF-κB信号活化能够促进细胞内相关信号分子的转录，诱导细胞核内 NLRP3 转录增加，NLRP3 炎性小体激活后，活化 caspase-1 自动切割 pro-IL-1β和 pro-IL-18，形成活性 IL-1β和 IL-18 的释放，导致炎症反应的产生[46-47]。NLRP3炎症小体作为NOD样受体之一，在炎症反应中起到了重要的作用，NLRP3参与多种疾病的发生与发展[48]，而针刺可以通过调控NLRP3的表达改善相关疾病，例如，针刺百会穴和印堂穴可以降低NLRP3炎症小体的表达，改善患者抑郁状态[49]；电针可以减弱NLRP3炎症小体的激活和外泌体的释放，从而减轻肺气肿小鼠肺的炎症反应，缓解减轻肺气肿等[50]。但针刺后腧穴局部NOD样受体是否受到影响尚无明确的研究结果，这也为腧穴启动效应研究提供了一个新方向。

3.3 针刺后腧穴局部炎性因子表达增高炎性因子根据作用不同分为促炎因子和抗炎因子，促炎因子包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-5、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α和INF-γ等；抗炎因子包括IL-4、IL-10及TGF-β1等，各种炎性因子之间相互作用，产生诱导炎症表达或抗炎的作用。如INF-γ由免疫细胞产生，能够促进IL-6的表达，抑制IL-10的表达，具有早期炎症诱导剂的作用。

针刺可以产生明显的抗炎作用，以往研究证实，针刺可以降低促炎细胞因子的表达，提高抗炎细胞因子的表达[20，51-52]，但针对腧穴局部炎性因子的研究相对较少。病理状态下，腧穴局部炎症因子表达升高，尹鸿智等[53]对慢性萎缩性胃炎大鼠及正常大鼠的足三里穴局部进行观察，发现与正常大鼠相比，慢性萎缩性胃炎大鼠足三里穴区局部IL-6、IL-1β、TNF-α表达增高，这符合目前腧穴敏化特性的研究，针刺可以降低腧穴局部IL-6、IL-1β的表达，但TNF-α的表达升高，研究提示针刺可以对腧穴局部炎症因子产生影响，但炎症因子表达的高低与针刺时间是否有关系没有进行探究。因此，Zhang等[21]对佐剂诱导关节炎大鼠针刺后第1天、第7天和第15天“足三里”穴局部炎症因子的表达进行检测，发现针刺刺激在一定范围内可使腧穴局部炎症因子表达发生改变或有一定的改变趋势，针刺后腧穴局部促炎因子IL-6、IL-1β及TNF-α的表达升高，其中IL-6及IL-1β的变化与针刺密切相关，提示可能是与腧穴启动效应机制密切相关的炎性细胞因子。这项研究还发现，促炎相关因子IL-2、IL-12、INF-γ的表达从第1天至第15天有逐渐降低的趋势；而抗炎因子IL-4和IL-10从针刺后第1天到第15天有逐渐升高的趋势，虽无统计学差异，但提示针刺后腧穴局部产生炎症反应，随着针刺时间的推移，腧穴局部抗炎因子表达是否逐渐升高，炎症反应是否逐渐降低，这对腧穴启动机制的研究具有重要意义，值得进一步探索。

4 皮肤神经源性炎症反应可能是腧穴启动效应的主要因素之一

虽然腧穴的解剖结构在很大程度上是未知的，但是越来越多的研究表明，腧穴可以确定为皮肤神经源性炎症点[54]。皮肤神经源性炎症反应是指，皮肤在各种因素的刺激下，初级传入纤维释放相关肽类递质及P物质，引起局部皮肤血管扩张和充血，导致血浆蛋白渗出和白细胞聚集。Kim等[10]认为内脏疼痛能够在皮肤上产生神经源性斑点，这是由皮肤神经源性炎症引起，在皮肤上与内脏传入神经支配重叠，提示腧穴是皮肤上神经源性炎症的一种形式，刺激腧穴产生由小传入纤维的激活引起针刺感觉和对相关脏腑的治疗作用，可能是由于内源性阿片类物质的释放。并通过研究证实了高血压或结肠炎大鼠模型腧穴局部皮肤出现神经源性炎症反应，提示腧穴可能与皮肤上的神经源性验证点相同。Fan等[8]认为，神经源性炎症过程中释放的神经肽，如P物质(substance P，SP)，在针刺腧穴启动作用中发挥了重要的作用。通过针刺对高血压的抑制机制研究发现，SP是针刺改善高血压的重要神经肽，针刺作用很大程度上依赖皮肤SP的水平，虽然目前尚不清楚SP如何诱导针刺的作用，但SP已被证实可以调节皮肤角质，形成细胞中细胞因子，包括IL-6、IL-1β及TNF-α等，这些细胞因子也被认为与针刺效应有关[54-55]，且SP也被认为是腧穴电性质的基础。因此，作为诱发针刺腧穴启动作用的一种可能性解释，研究者认为针刺刺激可以诱导感觉传入终端释放SP，诱导针刺腧穴启动效应。

5 针刺后腧穴局部神经兴奋，启动腧穴效应

针灸可以通过躯体感觉传入神经激活相应的神经从而发挥机体调节作用的这一现象，可能是腧穴启动的神经生物学基础之一。既往研究显示，体表不同部位的机械刺激可以引发相应的自主神经活动改变，国内学者将此发现运用于针灸作用机制的研究中，揭示了电针诱发“躯体-自主神经”反射的规律和内在机制，也为腧穴启动效应机制的研究提供了新思路。2021年，在《自然》杂志的报道研究中，有学者通过分析特定神经元，对足三里穴与天枢穴抗炎效果进行对比，发现足三里穴能够激活迷走神经-肾上腺素能神经，产生显著的抗炎效果，从而在足三里穴局部找到了表达PROKR2神经的背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)神经元[56]。因此，腧穴能通过局部特定的神经元，激活迷走神经，发挥相应的调节作用，这也是腧穴启动效应的可能机制之一。

6 讨论

腧穴理论作为针灸学理论体系中的核心部分，研究者们从未停下对其本质认识的探索脚步。针刺腧穴的调节作用十分复杂，现代针灸学将腧穴作用于相关脏腑的作用机制与神经系统联系起来，并概括为两类[1]，一类是由神经节段性联系所决定的节段性效应，另一类是由超节段神经联系所决定的整体性效应。神经系统的节段性联系包括中枢机制和外周机制，中枢机制是指腧穴通过脊髓初级中枢及脊髓上中枢(延髓、丘脑)作用于相应脏腑；外周机制包括由脊神经节完成的长轴突反射与短轴突反射，外周机制通过组织产生神经源性炎性反应，将信息传递至相应脏腑[57-58]；脊髓水平以上的超节段联系包括神经-内分泌-免疫网络系统。不论是节段性效应还是整体性效应，腧穴作为针灸信息的初始应答部位，都需要被启动才能通过相应的机制将针灸信号级联放大，发挥对靶器官或者整体的调节作用。因此，腧穴启动是针灸发挥效应的关键。

腧穴作为疾病反应点，会出现多种异常形态，即人体在病理状态下，腧穴会出现多种形态的异常，此时腧穴处于“敏化态”，具有临床治疗意义。如果人体处于生理状态下，腧穴通常不会被反应出来，即处于“静息态”。因此，腧穴在临床上的应用，只有在一定的病理状态下才有意义，此时给予适当的刺激，腧穴才能被启动，发挥其调控相关脏腑乃至整体的作用，腧穴的“敏化特性”是腧穴启动的基础。

腧穴局部局限性的炎性反应可能是针刺信息启动的关键点之一，与多种机制相互作用，形成了腧穴局部的小网络。针刺刺激作为一种被动性的物理性刺激，作用于相关腧穴，腧穴局部神经元、免疫细胞及其他相关化学物质被激活，相互作用影响，触发了炎症反应，从而启动了针刺效应。值得注意的是，这种炎症反应是局限性的，并不会随着针刺时间的推移而扩大，抗炎因子也会随着针刺时间的增加而释放，但目前针对腧穴启动与时间效应的研究较少。针刺的作用机制不是单一的，而是多系统、多靶点的网状效应，因此腧穴的启动效应是否也存在网状效应对于揭示腧穴启动效应机制具有重要的作用。在目前的腧穴启动效应机制研究中，目标腧穴多为足三里、内关、天枢等，尚未对所有的腧穴进行探究，针刺刺激导致腧穴局部的炎症反应是否能启动所有的腧穴，启动效应机制之间是否存在共性或特异性，这值得我们进一步探索。此外，随着皮肤神经、神经内分泌轴、免疫系统之间交互作用网络的生物学体系建立，皮-脑-轴学说的现代概念也逐渐趋于完备，皮肤、神经、内分泌和免疫炎症之间是不可分割的，这也为腧穴本质的研究开拓了新思路。