姚丽萍,朱 松
(食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,无锡 214122)
硒元素是维系人体正常生命活动所必需的非金属元素,1988年,中国营养学会将硒列为人体必需的营养素[1]。已有报道的硒的生理学功能有:抗氧化、抗炎、抗病毒、提高免疫力、预防心脑血管疾病、降低患癌风险等方面[2-8]。随着人们生活水平的提高和健康保健意识的增强,富硒食品越发受到关注。关于富硒大米的研究报道多集中于育种栽培、成分分析、功能特性和产品开发等方面[9-14],富硒大米安全性特别是Se相关伴生元素方面的报道很少。由于Se及其相关元素伴生机制尚不明确,若在补硒的过程中,其伴生元素摄入量超过了国家限量标准,可能对人体带来危害[15],因此,亟需开展富硒大米等富硒食品中Se潜在伴生元素的相关研究。
本研究探索建立了一种同时测定大米中多元素的ICP-MS方法,对富硒大米和普通大米中硒的潜在伴随元素的含量进行测定,比较筛选确定大米中Se的潜在伴生元素,对其元素含量和相关关系进行分析,并根据伴生元素的含量判断食品安全风险,为实现安全补硒膳食风险的控制和明确硒伴生元素机制的研究提供参考。
以随机抽样的方式采购富硒大米样品共52批次,标示产地为湖北省恩施州、陕西省安康市、江西省宜春市、安徽省六安市、宁夏省青铜峡市、江苏省宿迁市等国内富硒地区地产标识为“富硒大米”的样品,标示含硒量范围7~80 μg/100 g,以随机抽样的方式采购普通大米52批次,购自本地粮食市场。104批次样品原包装规格为1、2.5、5、10 kg,质量等级均标示为一级,执行标准为GB/T 1354,每份样品采样量均不少于1 000 g,封于洁净的自封袋中,编号后于4 ℃冷藏备用。GBW100 45大米生物成分分析标准物质,4 ℃冷藏备用。多元素标液(5% HNO3)HX-F-B 5 324-0 001 231 741;Li、Mg、Y、Ce、Tl、Co调谐液,1 μg/L;浓硝酸(HNO3,69%),电子级;硫酸(H2SO4,98%)、氢氧化钠(NaOH,99%)、盐酸(HCl,36%)和过氧化氢(H2O2,30%),均为分析纯。
LM 3610盘式实验粉碎磨,BSA 124S 型电子分析天平,Multiwave 3 000微波消解仪,VB 15型赶酸器,7 500型电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS),Direct-Q 超纯水系统。
1.2.1 同时测定大米中26种元素的ICP-MS方法建立
以大米为检测对象,结合已有文献结论,确定硒及其他潜在伴生元素筛选范围为Pb、As、Cd、Cr、Tl、V、Co、Ni、Se、Fe、Mo、Sb、Sn、Na、Mg、K、Ca、Al、B、Ti、Mn、Cu、Zn、Sr、Ba、Hg,共计26 项元素,探索建立同步测定其总含量的ICP-MS方法。样品经预处理实验后,符合ICP-MS方法的检测条件,并满足损失较小,效率较高,成本较低的要求。在样品测定过程中,通过设置仪器参数使其符合相关测定条件,并充分考虑干扰及校正情况,实现硒及其他26种元素总量的同时测定。
1.2.2 同时测定大米中26种元素的ICP-MS方法的确证
线性关系:ICP-MS 检测方法的线性,是指所配制标准品的浓度与仪器响应值之间的拟合关系,用最小二乘回归法对数据进行处理,通过校正曲线得到一条近似直线,通过回归系数R2评价线性关系。
检出限(LOD)指在一定的置信水平区间内,从样品中检出低于空白基质背景值的目标物质的最低含量或最低浓度。定量限(LOQ)是指在分析含有已知浓度被测物时,在精密度和准确度均满足检测要求时被测物质可以被定量的最低含量或最低浓度。在实际的检测中,通常以信噪比(S/N)作为 LOD 和 LOQ 的评价依据。一般以S/N=3∶1时的检测浓度作为LOD,以S/N=10∶1时的检测浓度作为LOQ。
准确度:在既有方法基础上向质控样品中添加高、中、低3个不同水平浓度的标准物质,测定其回收率。
精密度:在既有方法基础上,同一样品经多次取样测定,所测得的值之间的接近程度,用变异系数CV表示。
可靠性:采用大米国家标准物质进行方法的可靠性验证,每种元素均重复测定3次,取平均值,将测定值与证书标准值进行比较,根据GB/T 27404—2008[16]中规定的相对标准偏差RSD进行评价。
1.2.3 两类大米中硒和其他元素总量测定和统计分析
根据确证的方法,对两类大米不同批次的样品进行测定,同时进行空白实验,重复测定3次取平均值,根据GB/T 22499—2008规定[17],富硒大米硒含量应在0.04~0.30 mg/kg区间内,低于0.04 mg/kg应判定为非富硒大米,高于0.30 mg/kg判定为硒含量超标大米,对被测样品测定结果的均值开展达标率和合格率统计,计算公式为:达标率=达到国标硒含量样品数量/样品总数×100%;符合度=达到标示含量样品数量/样品总数×100%。
1.2.4 大米中Se潜在伴生元素的比较筛选与风险评估
根据测定数据,用Excel 2010和SPSS 20.0软件对数据进行统计分析,筛选Se潜在伴随元素,对其进行显著性分析。并根据测定数据,按照GB 2762—2017规定限量[18],对测得的富硒大米中Se伴生元素进行含量分析,通过伴生元素含量是否符合国家限量标准来评估食品安全风险,以其含量的合格率表示,计算公式为:合格率=低于国家限量值样品数量/样品总数×100%
2.1.1 样品预处理方法
大米样品需经过消解的预处理过程。常见的消解方法有干灰化法、湿式消解法、微波消解法等,微波消解法损失小、速度快,且试剂使用少、污染风险低,因此选择微波消解法对样品进行前处理。
在测试前,待测样品经粉碎磨粉碎后过60目筛,储存于广口瓶中。称取0.5 g样品粉末(精确到 0.000 1 g)于微波消解罐中,加入5 mL HNO3,盖上罐盖放置30 min,放入微波消解仪进行微波消解。微波消解程序如表1所示。
表1 微波消解程序
待消解结束后,需将消解罐置于赶酸器上进行赶酸,温度过高可能导致目标元素达到挥发温度,经实验比较设置为160 ℃;综合实验时间,在赶酸至120 min时,消解液液滴缩小至豌豆大小后即冷却定容至25 mL,上机前过0.45 μm过滤备用,同时进行空白试验。
2.1.2 样品测定方法
采用电感耦合等离子体质谱仪测定硒及其他元素总量,使用内标法克服基体效应,利用碰撞反应池克服质谱干扰,根据含量水平和干扰情况选择相应同位素进行测定,并使用标准调谐液使仪器参数符合测定条件,检测信号为ICP-MS,工作参数条件如表2所示,每个样品重复测定3次,进行空白实验。
表2 ICP-MS工作参数
2.2.1 线性
准确量取适量多元素标准试剂进行逐级稀释,配置表3所示标准系列浓度,按照表2设定参数测定,以各元素浓度作为横坐标,响应值作为纵坐标,绘制标准曲线。
表3 多元素测定设置标准系列浓度汇总表
标曲测定结果如表4所示,因实际样品中硒及其潜在伴生元素的进样浓度可以通过稀释控制在各自元素的线性范围之内,本方法所选用的ICP-MS检测方法线性范围较宽,26种元素标准曲线的回归系数R2均大于0.995,回归系数较好,可满足实际样品的检测要求。
表4 多元素测定标准曲线结果汇总表
2.2.2 检出限和定量限
多元素测定检出限和定量限结果如表5所示,26种元素的检出限范围为0.000 1~1.0 μg/kg,定量限范围为0.000 3~3.0 μg/kg,方法的整体灵敏度较高,可以确保目标元素在较低浓度时仍能实现有效检出。
表5 多元素测定检出限和定量限结果汇总表
2.2.3 准确度和精密度
多元素测定准确度和精密度结果如表6所示,可以看出各元素的3个水平加标回收率范围在86.1~126.7%,变异系数波动范围在0.0~14.9%(n=6),说明该方法的准确度较好,精密度较高,可以实现目标元素含量的准确测定。
表6 多元素测定准确度和精密度结果汇总表(n=6)
2.2.4 验证实验
选择大米国家标准物质进行方法的可靠性验证,结果如表7所示,26种目标元素的测定值与标准物质中元素的标准值基本一致,其RSD波动范围在2.5%~12.5%,符合GB/T 27404—2008中规定要求,说明该方法具有较好的可靠性,能准确稳定反映出被测物质目标元素总量的真实情况。
表7 验证实验结果汇总表
2.3.1 富硒大米Se及其他元素的总量测定和统计分析
富硒大米中硒及其他元素总量的测定结果如表8所示,除Tl元素没有检出外,其他25种元素均有检出。这26种元素含量分布在不同量级水平,存在很大差异,总量均值由大到小依次为:K、Al、Mg、Ca、Na、Zn、Mn、Fe、Cu、Ti、B、Mo、Ba、Ni、Cr、Sr、Se、As、Pb、Cd、Sb、Sn、Co、V、Hg、Tl,其中平均含量值>500 mg/kg的元素为K和Al,共计2种;平均含量值在100~500 mg/kg 区间内的元素为Mg和Ca,共2种;平均含量值在1~100 mg/kg 区间的为Na、Zn、Mn、Fe、Cu、Ti,共6种;平均含量值在0.1~1.0 mg/kg 区间的为B、Mo、Ba、Ni、Cr、Sr、Se,共7种;平均含量值在0.01~0.1 mg/kg 区间的为As、Pb、Cd、Sb、Sn,共5种;平均含量值在0.001~0.01 mg/kg 区间的为Co、V、Hg,共3种。结果显示,富硒大米中的各元素含量差别很大。此外,检出的25种元素总量相对极差范围在56.7%~460.8%,数据的集中度不高,由大到小依次为Cr、Co、V、Cd、Se、Hg、Sr、Pb、Mg、Ti、Sb、Ni、Fe、As、B、Zn、Mo、Sn、Mn、K、Ca、Ba、Cu、Na、Al,其中,相对极差在400%~500%区间的为Cr,共1种;相对极差在300%~400%区间的为Co、V、Cd,共3种;相对极差在200%~300%区间的为Se、Hg、Sr,共3种;相对极差在100%~200%区间的为Pb、Mg、Ti、Sb、Ni、Fe、As、B、Zn、Mo,共10种;相对极差在50%~100%区间的为Sn、Mn、K、Ca、Ba、Cu、Na、Al,共8种。结果显示,在不同富硒样品中,相同元素总量在不同产地之间差异也较大,地域分布差异性明显。
表8 富硒大米中多元素总量结果表
市售富硒大米中Se达标率和符合度结果如表9所示,根据测定结果显示,总硒含量均有检出,含量范围为0.023~0.29 mg/kg,中位值为0.059 mg/kg,均值0.11 mg/kg。52批次样品中,有61.5%的市售富硒大米符合标准规定,51.9%的样品符合标示值,近50%的被测样品的硒含量与外包装标示值不符。
表9 市售富硒大米中Se达标率和符合度结果表
2.3.2 普通大米中硒及其他元素的总量测定和统计分析
普通大米中硒及其他元素总量的测定结果如表10所示,与富硒大米相同,除Tl元素没有检出外,其他25种元素也均有检出,含量分布在不同量级水平,总量均值由大到小依次为:K、Al、Mg、Ca、Na、Zn、Mn、Fe、Cu、Ti、B、Mo、Ba、Ni、Sr、Cr、As、Cd、Pb、Se、Sb、Sn、Co、V、Hg,其中平均含量值>500 mg/kg的元素为K和Al,共计2种;平均含量值在1~100 mg/kg区间的为Mg、Ca、Na、Zn、Mn、Fe、Cu、Ti,共8种;平均含量值在0.1~1.0 mg/kg 区间的为B、Mo、Ba、Ni、Sr,共5种;平均含量值在0.01~0.1 mg/kg区间的为As、Cr、Sb、Se、Sn、Pb、Cd,共7种;平均含量值在0.001~0.01 mg/kg 区间的为Co、V、Hg,共3种。结果显示,与富硒大米一样,普通大米中的各元素含量差别较大。
表10 普通大米中多元素总量结果汇总表
从表10还可以看出,检出的25种元素总量相对极差范围在53.9%~347.8%,数据的集中度不高,由大到小依次为Sr、Co、Cd、Pb、Hg、Sb、Se、V、Cr、Ti、Mg、Mo、Fe、As、B、Ni、Zn、Na、Sn、Ba、Mn、Ca、K、Cu、Al,其中,相对极差在300~400%区间的为Sr,共1种;相对极差在200%~300%区间的为Co、Cd、Pb、Hg,共4种;相对极差在100%~200%区间的为Sb、Se、V、Cr、Ti、Mg、Mo、Fe、As、B、Ni、Zn,共12种;相对极差在50%~100%区间的为Na、Sn、Ba、Mn、Ca、K、Cu、Al,共8种。结果显示,在不同普通大米的样品中,相同元素总量在不同产地之间差异也较大,地域差异性分布也十分显著,这与富硒大米各元素含量的情况一致。
市售普通大米中Se含量情况如表11所示,根据测定结果显示,总硒含量均有检出,含量范围为0.011~0.049 mg/kg,中位值为0.018 mg/kg,均值0.022 mg/kg,说明市售大米存在不同水平的硒,但总硒含量的整体水平较低,52批次样品中有6批次样品达到了标准低限,符合国家相关标准对富硒大米要求,其占比达到了11.5%。
表11 市售普通大米中Se达标率和符合度结果表
2.3.3 富硒大米和普通大米硒含量及其他元素含量的比较分析
同时测定富硒大米和普通大米26种元素总量,见表12,富硒大米和普通大米被测的元素,除Tl元素没有检出外,其他25种元素均被检出,且含量水平、差异化程度类似。常量元素K、Al、Mg、Ca、Na和微量元素 Zn、Mn、Fe、Cu、Ti、B、Mo、Ba、Ni、Sr、Cr、As、Cd、Pb、Se、Sb、Sn、Co、V、Hg 在相应的量级水平情况基本相似,部分元素含量存在一定差异。从含量分布上看,不同元素在地区和类别间,均显示除较大的差异,集中度不高,表明元素的含量受地域分布和大米品种影响很大。
表12 富硒大米和普通大米中多元素含量的比较结果表
按总量均值和中位值进行含量高低进行排序时,可以发现,以Ni元素为分界点,总量均值和中位值高于Ni元素时,这两类大米元素排序保持一致,含量低于Ni元素含量排序发生了一定的变化,相较于普通大米,Se元素在总量和中位置均表现为排名同时上升,与此同时,Cr、Pb和Cd 3种元素总量均值排序相应上升,Sr、Sb和As 3种元素有所下降,这与中位值排序上变化相似,另外通过比较可以发现,与Se元素中位值排序同步上升的元素除了Cr、Pb和Cd外,Hg元素的中位值也上升了1位,通过比较可明确,在富硒大米中,与Se伴生且含量较高的潜在元素有Cr、Pb、Cd和Hg 4种元素。
2.3.4 富硒大米中伴生元素的分析和确证
对富硒大米样品中的硒及其潜在伴生元素含量数据,数据利用SPSS 20.0 软件进行分析,得到硒与 4 种金属元素之间的相关关系,结果见表13。经显著性分析,在富硒大米中,Se与Cd呈现极显著的正相关关系,与Cr呈现显著的正相关关系。因此,在富硒大米中,Se的主要伴生元素为Cd,这与已有报道中的相关结论相符[19,20]。
表13 富硒大米硒及其潜在伴生元素显著性分析表
2.3.5 富硒大米Se主要伴生元素风险评估
根据2.3.5结果,以Cd为硒主要的伴生元素进行含量分析,结果如表14所示。根据GB 2762—2017规定,大米中Cd的限量值为0.2 mg/kg,52批次富硒大米的Cd含量区间为0.005 1~0.11 mg/kg,均值为0.035 mg/kg,中位值为0.021 mg/kg,检测值均低于限量标准,样品中Cd含量合格率为100.0%,均符合国家标准。
表14 富硒大米中Cd合格率情况汇总表
本研究以富硒大米为检测对象,以大米国家标准物质为参考,建立了同时测定硒及其他潜在伴生元素包括Pb、As、Cd、Cr、Tl、V、Co、Ni、Se、Fe、Mo、Sb、Sn、Na、Mg、K、Ca、Al、B、Ti、Mn、Cu、Zn、Sr、Ba、Hg共计26 种元素总量的ICP-MS检测方法,并从线性、准确性、精密度和可靠性方面进行了方法学的确证,结果显示方法回归系数R2均大于0.995,检出限范围为0.000 1~1.0 μg/kg,定量限范围为0.000 3~3.0 μg/kg,加标回收率为范围在86.1%~126.7%,变异系数波动范围在0.0%~14.9%,此ICP-MS方法线性范围较宽、选择性好、灵敏度高、准确性好,是富硒大米多元素检测方便高效的检测方法。
通过对随机抽取的富硒大米和普通大米104个样品的测定结果比较可知,富硒大米和普通大米中各元素含量差别较大,市售富硒大米硒含量的整体水平不高,52批次样品中,有61.5%的市售富硒大米符合标准规定,51.9%的样品符合标示值,近50%的被测样品的硒含量与外包装标示值不符,存在总硒含量不符的情况;市售普通大米存在一定水平的硒,但硒含量的整体水平较低,52批次样品中,有6批次样品达到了标准低限,占比为11.5%。通过多元素同步检测,发现相较于普通大米,富硒大米的Cr、Pb、Cd、Sr、Sb、As、Hg和V这8种元素含量排序发生了变化,其中,Cr、Pb、Cd和Hg4种元素含量显示与Se同向增长,且差异化程度较高,可初步确定为Se的潜在伴生元素。经显著性分析,可以发现,在富硒大米中,Se与Cd呈现极显著的正相关关系,与Cr呈现显著的正相关关系,说明在富硒大米中Se的主要伴生元素为Cd。经含量统计分析,52批次富硒大米的Cd含量合格率为100.0%,进一步说明了以富硒大米作为膳食补硒渠道导致摄入Cd超标的食品安全风险较小。