常用抗菌药物中非法添加氯霉素类药物的检测方法研究

刘 佳，高 婷，王亚芳，李应超

（北京市兽药监察所 102629）

我国畜牧业生产中每年抗生素使用量占全球抗生素使用量的30%，是世界上使用抗生素最多的国家之一。阿莫西林可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉、酒石酸泰乐菌素可溶性粉、盐酸林可霉素可溶性粉、硫酸粘菌素可溶性粉、阿维菌素粉等常用抗菌药物，具有良好的抑菌、杀菌作用， 临床应用广泛[1-3]。随着我国兽药市场竞争的日益激烈，一些不法厂家为了提高抗菌药物的疗效，追逐片面的经济利益，而在兽药处方外非法添加其他药物。这种情况极易导致用户不知情的情况下，大剂量或长时间连续使用时，带来药物超量使用的中毒风险和药物残留隐患，导致细菌耐药性的产生，动物性产品药物残留超标，继而通过食物链传递，造成食品安全隐患，给人类健康造成严重的危害[4-6]。为此，农业农村部发布了多个涉及兽药非法添加检测方法的国家标准[7-8]，这对打击兽药处方外添加行为提供了强有力的技术支撑。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等属于氯霉素类药物，具有广谱抗菌性，能够抑制革兰氏阳性菌和阴性菌，用于预防和治疗细菌感染效果较好[9-11]。然而，研究发现氯霉素对人类的造血系统有较大的毒性作用，甲砜霉素会抑制红细胞的生成，氟苯尼考具有胚胎毒性[12-13]。但时常发现氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等氯霉素类药物作为非法添加物质在其他处方外添加。目前该类药物的检测方法主要有液质联用技术[14-15]、高效液相色谱[16-19]、薄层色谱分析[20-21]、显微鉴别[22-23]，其中高效液相色谱分析速度快、分离性能高，双重定性保留时间及紫外图谱，减小了假阳性的可能性。为进一步完善兽药非法添加检测国家标准体系建设，本试验建立了以二极管阵列检测器（PDA）为检测手段同时检测常用抗菌药物中违规添加甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的高效液相色谱法。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂

电子天平（Mettler Toledo），高效液相色谱仪（Agilent 1100）。甲醇、乙腈（Fisher），MilliQ-Gradient 超纯水系统。

1.2 对照品

氯霉素对照品（来源：中国药品生物制品检定研究院，批号130555-201203，含量99.8%）、甲砜霉素对照品（来源：中国兽医药品监察所，批号K0241406，含量99.7%)、氟苯尼考对照品（来源：中国兽医药品监察所，批号K0301305，含量99.3%)。

1.3 供试品

阿莫西林可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉、酒石酸泰乐菌素可溶性粉、盐酸林可霉素可溶性粉、硫酸粘菌素可溶性粉、阿维菌素粉等常用抗菌药物，抽检或审批合格产品。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Atiantis®T3 5μm 4.6×250mm。A为甲醇；B为乙腈； C为水，梯度洗脱。流速1.0mL/min；检测波长为278nm和224nm；进样体积为10μL。洗脱方法如表1所示。

表1 梯度洗脱方法

2.2 标准溶液的制备

2.2.1对照品储备溶液 使用40%甲醇为溶剂，分别配制氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、浓度为0.5mg/mL、0.5mg/mL、1.25mg/mL，用时稀释至相应浓度。

2.2.2 系统适用性溶液 使用40%甲醇为溶剂，分别配制氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、浓度为50 μg/mL。

2.3 样品溶液的制备

2.3.1 阴性样品储备溶液 0.50g→ 50mL，溶剂为 40%甲醇，6000 r/min离心5min，取上清液备用。

2.3.2 阴性样品溶液 精密量取2.3.1溶液1 mL，精密加入9 mL 40%甲醇溶液，混匀。

2.3.3 阳性样品溶液 精密量取2.3.1溶液1 mL，精密加入2.2.1溶液1 mL和8 mL 40%甲醇溶液，混匀。

2.3.4 阳性添加样品 按照5%、5%、12.5%的比例添加3种氯霉素类药物。

2.4 重复性考察

准确量取系统适用性溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，计算各组分峰面积的相对标准偏差(RSD)，考察标液的重复性。

2.5 标准曲线的绘制

使用40%甲醇为溶剂， 3种氯霉素类药物的浓度分别为500、250、100、50、25、10μg/mL，按照2.1项下色谱条件进行测定，平行测定3次，记录峰面积，取其平均值，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标做线性回归。

2.6 检测限的测定

精密取2.3.1各1mL，精密加入2.2.2适量（0.8mL、0.5mL和0.6mL），40%甲醇为溶剂至10mL，摇匀，按2.1条件检测，根据光谱失真程度确定检测限。

2.7 方法的准确度和精密度

精密取各阴性样品储备液1mL，按照2.3.4中三种氯霉素类药物常用规格的80%、100%、120%的比例分别添加氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考三种药物（加入对照品储备液0.8mL、1.0mL、1.2mL），按照2.3.2处理，平行测定3次，计算加标回收率和RSD。

3 结果与分析

3.1 系统适用性

取40%甲醇溶液、2.2.2、2.3.2、2.3.3，按2.1色谱条件下进样，记录色谱峰。见图1-6，在此测定条件下，各阴性样品溶液、40%甲醇溶液对三种药物测定没有干扰，各药物之间的分离度良好，甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的出峰时间分别为9.3min、19.1min、24.2min。各目标峰纯度角小于纯度阈值，表明峰的纯度较好，见图7-12。

图1 40%甲醇溶液色谱图

图2 氯霉素类药物对照品溶液（50 μg/mL）色谱图

图3 阿莫西林可溶性粉-空白色谱图

图4 阿莫西林-添加色谱图

图5 硫酸新霉素可溶性粉-空白色谱图

图6 酒石酸泰乐菌素可溶性粉-空白色谱图

图7 甲砜霉素-对照品（50 μg/mL）光谱图

图8 甲砜霉素-对照品（50 μg/mL）纯度峰

图9 氟苯尼考-对照品（50 μg/mL）光谱图

图10 氟苯尼考-对照品（50 μg/mL）纯度峰

图11 氯霉素-对照品（50 μg/mL）光谱图

图12 氯霉素-对照品（50 μg/mL）纯度峰

3.2 重复性考察

按照方法2.4处理样品，进样，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考色谱峰面积的变异系数分别为0.13%、0.11%、0.11%，表明在2.1条件下检测，标液精密度良好。

3.3 标准曲线

在本试验的色谱条件下，甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的标准曲线和相关系数可知（见图13），三种药物在10～500ug/mL浓度范围内时，药物浓度与相应峰面积线性关系良好，相关系数R2均在0.999以上。

图13 氯霉素类药物标准曲线方程与相关系数

3.4 检测限

本法对所检测药物中氯霉素及氟苯尼考的LOD均为4g/kg、甲砜霉素的LOD为3g/kg。

3.5 加样回收率试验

在不含有氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考3种氯霉素类药物的抗菌药物中添加阳性样品，其分离良好。按外标法计算加标回收率，回收率在98.8%～102.1%范围内，RSD为0.4%～1.1%，其试验结果见表2。

表2 抗菌药物中添加氯霉素类药物（甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素）的回收率和RSD（n=9）

4 讨论与结论

4.1 抗菌药物种类的选择

抗菌药物种类繁多，常用于兽医临床的有几十种。为便于研究和应用，一般根据它们的化学结构分为β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、林可胺类、多肽类等种类。本试验选择检测概率较大的五种药物，阿莫西林可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉、替米考星预混剂、盐酸林可霉素可溶性粉和阿维菌素粉。几种药物均对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌有效，为增大药效，不良厂家存在添加氯霉素类药物的可能性。

4.2 色谱柱及柱温的选择

本试验共测试3种Waters色谱柱，1种Agilent色谱柱，考虑目标物质的分离度，灵敏度和保留时间，只有Waters Atiantis®T3 5μm 4.6×250mm对甲砜霉素保留时间较长，能使目标成分有效的分离，与其他成分峰不产生干扰。因此选择该型号色谱柱。改变柱温，未见色谱图峰型及保留时间有明显变化，考虑到本方法检测较多样品及采用梯度洗脱的方式，试验选择以35℃为检测温度，以提高色谱峰的重现性。

4.3 流动相的选择

为防止仪器堵塞，延长柱子使用寿命，流动相应尽量避免加入酸或盐类物质。本试验探究了水、甲醇、乙腈三种流动相组合，三种物质混合流动相比两两混合效果要好，因此选择甲醇-乙腈-水三者混合流动相。由于抗菌药物结构的一致性，等度洗脱未能完全实现药物的基线分离，因此选择梯度洗脱，洗脱程序为表1-1，可实现目标物之间的有效分离。

4.4 结论

本试验采用高效液相色谱-二极管阵列检测器建立的抗菌药物中非法添加氯霉素类药物检查方法，可实现目标物与其他成分之间的有效分离，同时该方法环境友好、快速、重现性好，可用于抗菌药物中氯霉素类药物的检测。此外，经试验验证，该方法对于中兽药等固体药物制剂中氯霉素类非法添加的检测也具有较好的效果。