超声提取广西白木香叶黄酮的工艺研究

苏伟雄

515300广东省普宁市中医医院药学部，广东普宁

资料与方法

实验所使用的材料为白木香叶，取材所用白木香来自于广西的沉香种植园，经定种确定为白木香，取叶于实验室条件下洗净晾干，剪碎后以粉碎机打成粗粉，以50℃烘干15 min后混匀过60目筛。

试剂：无水乙醇、醋酸钠、乙酸钠与芦丁标准品。

仪器：除实验室常用仪器外，本文所使用的主要仪器见表1。

表1 实验主要仪器

方法：实验首先构建标准曲线，然后通过重复实验测定方法的有效性，最后进行正交实验。①构建标准曲线，精密称取20 mg芦丁标准品，以60%乙醇转移至10 mL 容量瓶中并仔细冲洗，使用60%乙醇定容，颠倒多次使之均匀，形成标准液。精密吸取0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL标准液于试管中，逐个加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3，3 mL 1 mol/L 醋酸钠和5 mL 60%乙醇，于室温下反应20 min，以60%乙醇转移至10 mL容量瓶中并定容，分别于分光光度仪450 nm 波长下测定吸光度从而构建标准曲线。②构建提取方法，准确称取1 g白木香叶过筛干粉，置于50 mL离心管中，加入一定浓度和体积的乙醇，置于超声波粉碎仪，设定超声工作模式，即5 s超声与静置交替，功率50 W，持续工作一段时间后取出冷却，6 000 r/min离心20 min后取上清液，于分光光度仪450 nm 波长下测定。测定结果根据标准曲线计算获得对应总黄酮含量。③进行精密度测试、重复性测试、加样回收与正交实验。正交实验的条件设置见表2。

表2 正交实验条件

结果

标准曲线：实验测定结果显示芦丁浓度与吸光度结果见表3。

表3 芦丁浓度与吸光度间的关系

基于此，则可相应绘制标准曲线，其标准曲线见图1。

图1 标准曲线

如上表所示，标准曲线函数为y=0.259x+0.385，R2=0.994，基于此，可以进一步测定待测白木香叶中的总黄酮含量，从而对其进行提取工艺优化。

精密度实验：精密度测试结果见表4。

如表4所示，平行实验下不同样本的标准差普遍较小，显示出超声提取法的方法稳定性相对较高，实验方法的精密度较高，方法可靠性良好。

表4 精密度测试结果

重复性实验：重复性测试结果见表5。

表5 重复性测试结果

重复性实验中超声提取法有着相对较低水平的标准差和较低水平的相对标准差，总体上重复性实验表现相对较好，显示出重复性测试自身的稳定性，能够得到更为稳定的检测结果。

加样回收实验：加样回收实验结果见表6。

如表6所示，加样回收的结果稳定性极高，全部加样回收实验测定的回收率均围绕着98.4%上下波动，波动幅度极小，不同称样量下的相对标准差高度接近，显示出方法良好的稳定性和回收率。

表6 加样回收实验结果

正交实验：正交实验的测定结果，见表7。

如表7所示，不同浓度乙醇对测定结果的影响显著，60%浓度乙醇显著表现出较好的提取率，不同条件下实验测定总黄酮类物质平均提取率可以达到4.9%。稍高或稍低于60%浓度的乙醇的提取率均有着较大差异，而与此同时，60%浓度的乙醇提取方法也表现出了最低水平的相对标准偏差，进一步验证了这一方法的有效性和稳定性。见表8。

表7 不同浓度乙醇测定结果整理

如表8 所示，不同料液比对测定结果的影响显著，25 mL乙醇∶1 g白木香叶过筛干粉显著表现出较好的提取率，不同条件下实验测定总黄酮类物质平均提取率可以达到5.07%。稍高的料液比同样能够取得较高的提取率，30 mL乙醇∶1 g白木香叶过筛干粉仍然能够达到平均5.01%的提取率，整体而言料液比的影响较为显著，在剔除料液比变化的条件下，不同乙醇浓度与不同超声处理时间累积形成的相对标准偏差普遍较低。见表9。

表8 不同体积乙醇测定结果整理

如表9所示，不同超声处理时长对于测定结果影响显著，20 min 的处理时长显著表现出较好的提取率，不同条件下实验测定总黄酮类物质平均提取率可以达4.89%。

表9 不同超声处理时长测定结果整理

累积考虑不同影响因素，全部正交实验结果中的最高平均提取率60%乙醇25 mL∶1 g白木香叶，过筛干粉经20 min 超声处理后所获得的提取率是5.62%，该提取率为最高值，符合各类正交实验分类测定对比结果形成的最佳工艺条件。

讨论

白木香又称沉香，是我国传统中药材。沉香取自其具树脂的茎，白木香叶非传统入药部位，较少得到研究者关注。白木香叶中的天然活性成分较多，主要为总黄酮类物质，其与沉香的结香过程密切联系，从而得到了较多研究与讨论。

中药材中，沉香多来自于我国西南地区与东南亚地区，而国产沉香则为桃金娘目瑞香科，沉香属白木香，种于广州和云南部分地区，称白木香，于广东地区又称女儿香、芫香，于《海南植物志》称香材，于《中国植物志》称土沉香，于《本草纲目拾遗》称栈香，于《名医别录》称沉香。白木香老茎受伤产出的树脂称沉香，可作香料。

相较于沉香，白木香叶并非白木香的传统药用部位，相应化学成分分析和药用价值研究相对较少。梁林源和甘超胜(2019)采用文献研究、访谈法和野外调查法等方法调查、了解了野生白木香叶中的黄酮类物质，对其研究现状进行综述，对其抗癌活性进行实验测定。汪元元等[1](2019)对白木香叶相关领域的研究进展进行了综述，对其化学成分及其所具有的药理价值分别进行了分析与讨论，并从活性化学成分、提取工艺优化等角度分别进行了综述。

本文构建了白木香叶中总黄酮的超声提取方法，实验测定形成标准曲线而使得实验人员能够基于这一方法与标准曲线测定样本白木香叶中的黄酮含量。精密度实验显示其多组平行试验的结果，标准差仅为0.000 35；重复性实验的标准差与相对标准偏差扩大，说明需要经过重复性实验以稳定实验结果；加样回收实验显示出实验方法高度稳定，相对标准偏差约为0.001 7。

黄酮类物质自身属于植物常见的次生代谢产物，包含黄酮、黄酮醇、异黄酮、鞣酐、原花青素、花色素和橙酮等，普遍以苯丙氨酸为共同前体，与结香过程中的抗逆性密切联系，因而在代谢过程和提取工艺方面普遍有着较高的相似性，总称黄酮类物质。大量先行研究对超声提取黄酮类物质的测定方法进行了多样化的研究。黄靖等[2]对福建佛手采用超声提取总黄酮的工艺进行了分析，测定采用60%浓度乙醇与料液比1∶35 提取方式取得最高提取率。肖牧原[3]对于超声提取薄荷总黄酮工艺进行了优化，测定采用41.14%浓度乙醇与21.57∶1料液比能够获得最大提取效率。邹维等[4]对超声聚能醇盐双水相提取藜麦中的总黄酮工艺进行了分析，测定采用固液比28∶1与醇水体积比0.9∶1为最佳条件。王志伟等[5]对超声辅助提取三七花总黄酮工艺进行了优化，测定采用73%浓度乙醇与料液比1:40提取方式取得最高提取率。

综上，有关于植物中黄酮类物质超声提取的相关工艺研究与分析数量较多。所采用的超声提取工艺多为醇提法，使用固液比和醇水比普遍较大。对比而言，白木香叶所采用固液比较小而乙醇浓度较低，主要来自于白木香为革质叶而使醇提法需水量增长。