延黄牛脂制备高纯度1，3-甘油二酯工艺

曲可心

高青山1,2

姚辉耀1

刘龙龙1

张 华1,2

李铉军1

(1. 延边大学农学院，吉林 延吉 133002; 2. 延边大学东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心，吉林 延吉 133002)

延边黄牛因其适应能力强、产肉率高且肉质鲜美多汁等备受欢迎，是目前中国较好的肉牛培育品种之一[1]。其宰前重量为500 kg时，含牛脂约25～50 kg，占体重的5%～10%。延黄牛脂是由健康牛新鲜、干净和完整的脂肪组织提炼而成，精炼后的牛脂呈类白色或浅黄色，因其风味特殊可用于火锅底料、烘焙制品、调味品等各类食品加工中[2-3]。

现代火锅以川渝火锅为代表，其底料油大多采用牛油(甘油三酯)，然而牛油因饱和脂肪酸及胆固醇含量较高，过多食用会损害人体健康[4]。而结构酯是通过改变甘油三酯中脂肪酸的种类及位置得到的人工合成脂质，可以实现特定的理化性质与生理作用。研究[5]表明，1,3-甘油二酯(sn-1,3-DAG)因其消化途径与甘油三酯不同，具有减少脂肪累积、抑制体重增加、预防高血脂的作用。sn-1,3-DAG作为火锅底料油替代品将在一定程度上具有预防及缓解肥胖症、心血管疾病、脂肪肝等疾病的作用。

1,3-甘油二酯的制备方法根据催化剂不同可分为酶法和化学法；根据工艺步骤可分为一步法和两步法等[6]。与化学法不同，酶法催化制备的sn-1,3-DAG具有无环境污染、生产得率高、产品色泽良好等优点。为获得高纯度的甘油二酯，需对制备后得到的产物进行纯化分离，目前纯化甘油酯的方法主要有超临界CO2萃取法、溶剂结晶分离法、分子蒸馏法和柱层析法等[7-8]。而测定sn-1,3-DAG含量的最新方法为核磁共振法(1H-NMR)，该方法消耗样品少，且无需分离复杂的混合物，还具有同时测定样品中多种成分含量的优点[9]。孟祥河等[10]以香榧籽油为原料，采用乙醇钠催化富集金松酸(SCA)并用于酯交换反应生产1,3-甘油二酯，其中Lipozyme RM IM的位置选择性较佳，1,3-DAG产率最高。Vazquez等[11]证明了以甘油和混合脂肪酸为原料，脂肪酶RM IM为催化剂，在酶添加量为5%，50 ℃反应4 h的条件下，无溶剂体系中DAG产率达84.0%。郭婷婷等[12]采用分子蒸馏技术对花生油甘油二酯产物进行分离，其产品纯度为85%，得率为18.54%。

目前，以天然延黄牛脂为原料，经脂肪酶的醇解酯交换反应生产富含sn-1,3-DAG的火锅底料油替代品的研究尚未见报道。试验拟以延黄牛脂为原料，利用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM在无溶剂体系中催化发生酯交换反应，运用1H-NMR法测定反应产物，分析脂肪酶添加量、底物摩尔比、反应温度、反应时间对sn-1,3-DAG含量变化及甘油酯得率的影响，并运用弗罗里硅土吸附法进行提纯，旨在为延黄牛脂制备新型火锅底料油的开发和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

延边黄牛牛脂：实验室自制；

氢氧化钾、无水硫酸钠、丙三醇、无水乙醇、正己烷：天津市科密欧化学试剂有限公司；

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM：酶活力250 IUN/g，诺维信(中国)生物技术有限公司；

氘代氯仿-d(D，99.8%)、四甲基硅烷(TMS，体积分数0.03%)、弗罗里硅土(F196373)：上海阿拉丁试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

往复式恒温震荡水浴培养摇床：SPF-110X12型，上海世平实验设备有限公司；

电子分析天平：FA-1004型，上海良平仪器仪表有限公司；

低速多管架自动平衡离心机：TDZ5-MS型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

旋转蒸发仪：R201D型，上海一科仪器有限公司；

集热式恒温加热磁力搅拌器：IT-09B15型，上海一恒科学仪器有限公司；

核磁共振波谱仪：Bruker AVANCE III 500MHz型，德国Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 延黄牛脂提取 延边黄牛脂肪切割成小块，并将适量水同入锅中，加热熬制2 h，捞出悬浮于表层的油于烧杯中，按V油∶V正己烷为1∶1加入正己烷，加入无水硫酸钠进行抽滤，使用旋转蒸发仪去除溶剂，获取纯净牛脂[13]。

1.2.2 延黄牛脂脂肪酸乙酯的制备 称取50 g延黄牛脂于250 mL三颈烧瓶，65 ℃水浴预热，加入氢氧化钾—乙醇溶液(氢氧化钾质量为牛脂的1%，n无水乙醇∶n牛脂为6∶1)，磁力搅拌下回流1 h。将烧瓶中的混合液置于分液漏斗中，加入适量正己烷，用热水进行洗涤(重复多次至彻底洗净)。使用无水硫酸钠除去上层有机相残留水分，运用旋转蒸发仪除去有机相中剩余乙醇和正己烷，得牛油脂肪酸乙酯[14-15]。

1.2.3 薄层色谱条件 以油酸乙酯标准品为标样，将样品与正己烷[V样品∶V正己烷为20∶10 (μL/mL)]混匀备用。以V石油醚∶V乙醚∶V冰乙酸为90∶10∶1为展开剂，充分混匀后倒入展开缸中，密封备用。向显色层析缸中加入一层海砂和5～6粒固体碘，密封0.5 h使碘充分饱和，备用。用毛细管在硅胶板上距离底边1.5 cm处点样。当样点上的溶剂充分挥干后，将硅胶板置于展开缸中，使展开剂从板的一端向另一端进行浸润展开，待其距板上端1 cm 处停止展开，干燥后，将硅胶板置于碘缸中显色[16]。

1.2.4 酶促酯交换反应合成1,3-DAG 称取5 g牛油脂肪酸乙酯于50 mL具塞锥形瓶中，加入一定量的甘油混匀，恒温水浴摇床(80 r/min)中预热，加入一定量的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM开始酯化反应并计时。分别考察底物摩尔比(n脂肪酸乙酯∶n甘油分别为1.0∶1.0，1.5∶1.0，2.0∶1.0，2.5∶1.0，3.0∶1.0)、酶添加量(1%，3%，5%，7%，9%)、反应时间(2，4，6，8，10 h)和反应温度(35，40，45，50，55 ℃)对甘油二酯含量的影响。离心后对上层清液进行1H-NMR检测，并按式(1)计算反应产物得率。

图1 牛油脂肪酸乙酯薄层色谱图Figure 1 Thin layer chromatography of fatty acidethyl ester in butter

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量5%，反应时间6 h，反应温度50 ℃；同一指标字母不同表示差异显著(P<0.5)

(1)

式中：

c——反应产物得率，%；

m1——上层清液质量，g；

m2——反应物质量，g。

1.2.5 弗洛里硅土法纯化 取适量m弗罗里硅土∶m混合酯为5∶1的弗罗里硅土和混合酯于150 mL磨口三角瓶，吸附25 min。加入50 mL分析纯正己烷，100 r/min搅拌10 min，过滤，反复洗脱9次，收集甘油三酯洗脱液，并同时点板确认有无甘油二酯出现，旋转蒸发除去正己烷，得甘油三酯。向磨口烧瓶中加入60 mL正己烷—乙醚溶液(V正己烷∶V乙醚为16∶1)，100 r/min搅拌10 min，洗脱，重复3次，过滤除去甘油二酯和甘油三酯混合物。向磨口烧瓶中加入50 mL分析纯乙醚，100 r/min搅拌10 min，反复洗脱3次。收集洗脱溶剂，利用旋转蒸发仪去除乙醚，采用1H-NMR分析最终产物甘油二酯纯度。

1.2.6 运用氢谱(1H-NMR)测定官能团

(1) 样品制备：准确称量反应产物溶于1 mL氘代氯仿中，以TMS为内标，混合摇晃至完全溶解，过0.45 mm有机相滤膜，转移至5 mm核磁管中，制成待测样品，备用。

(2) 1,3-DAG定量：待测样品中酯交换产物含量以内标TMS计算而来，其计算式为：

(2)

式中：

W1,3-DAG——产物中1,3-DAG摩尔含量，%；

As——试样特征峰峰面积。

(3) 脂肪酸定量：参照María等[17]的方法测定油脂中油基(O)、亚油基(L)、亚麻基(Ln)和饱和酰基(S)比例，并根据延黄牛脂分析1H-NMR官能团。

1.2.7 数据分析 所有试验数据均以均值表示，平行3次。采用SPSS 25.0软件进行数据分析，P<0.05判定为统计学显著。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱分析

实验室自制牛油提取率为82%。由图1可知，延黄牛脂经乙酯化后得到的牛油脂肪酸乙酯薄层层析展开情况良好，斑点分离度高。牛油脂肪酸乙酯中存在与油酸乙酯标准品基本一致的斑点，说明牛油脂肪酸乙酯纯度较高，可以进行后续甘油二酯制备试验。经计算，延黄牛脂、牛油脂肪酸乙酯、油酸乙酯(标品)的Rf值分别为0.309，0.713，0.738。

2.2 单因素试验

2.2.1 底物摩尔比 由图2可知，不同底物摩尔比下，1,3-DAG和甘油三酯(TAG)摩尔含量无显著性差异(P≥0.05)，但反应产物得率从54%逐渐升高至67%。从理论上看，任何一种底物摩尔数的改变都会影响体系的稳定性及产物的扩散速率与含量，当n脂肪酸乙酯∶n甘油为2∶1时，1,3-DAG的摩尔含量达最佳，因为甘油二酯是由2分子的脂肪酸乙酯与1分子的甘油组成。脂肪酸乙酯含量过多，则利用底物的程度降低，同时导致纯化过程复杂，耗时过长；甘油含量过多，则体系的极性大，甘油与脂肪酶将更易沉积于底部，因此与脂肪酸乙酯混合不充分，降低反应速率[18]。故选择反应底物摩尔比(n脂肪酸乙酯∶n甘油)为2∶1。

2.2.2 酶添加量 由图3可知，随着酶添加量的增加，1,3-DAG和甘油三酯的摩尔含量无显著性差异，甘油酯得率从77%下降至47%。酶催化酯交换反应过程中会生成过多水，当水分含量超过一定量后，脂肪酶的酯化活力大大降低，表现出较高的水解活力。酶维持活性中心构象需保持一定的柔性，而适量的水分活度正是维持这种柔性的需要[19]。孟祥何等[9]研究发现，当加酶量为5%，底物摩尔比(n乙酯∶n甘油)为2∶1时，1,3-甘油二酯产率达55.5%。当固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量为1%时，甘油二酯产率达77%，大幅度降低了生产成本。

2.2.3 反应温度 由图4可知，随着反应温度的升高，1,3-DAG、甘油三酯的摩尔含量及得率均无显著变化。而适宜的温度控制是酶促反应的关键，升高反应温度有利于去除酯交换反应副产物中的水，一定程度上加快反应速率，同时物质在反应体系中的溶解度会有较大提高，体系黏度低，传质速率快，因此反应速度快。温度过高，则会导致大部分酶被破坏，发生不可逆变性，从而丧失酶的催化作用[20]，因此，控制适当的反应温度为35 ℃。

2.2.4 反应时间 由图5可知，随着反应时间的延长，1,3-DAG、甘油三酯的摩尔含量及得率均无显著变化。固定化脂肪酶Lipozyme RM IM为1,3-位特异性脂肪酶，假设该酶的位置选择性完全专一，理想状态下反应结束时应该全部连接到甘油酯骨架的sn-1和sn-3位置上，即仅生成sn-1,3-DAG，而试验结果显示反应2～10 h，混合酯中均存在甘油三酯，说明发生了副反应——酰基迁移，也有研究[21]表明，通过适当控制反应时间可以在一定程度上抑制酰基迁移。综合考虑，选择反应时间为6 h，此时甘油酯得率为77%，显著高于(P<0.05)反应时间为2 h的(67%)。

n脂肪酸乙酯∶n甘油为2∶1，反应时间6 h，反应温度50 ℃；同一指标字母不同表示差异显著(P<0.5)

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量1%，n脂肪酸乙酯∶n甘油为2∶1，反应时间6 h

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量1%，n脂肪酸乙酯∶n甘油为2∶1，反应温度35 ℃

2.3 甘油二酯纯化

酯化反应过程中会产生1,3-DAG、1,2-DAG、TAG、FFA、MAG等脂肪酸产物，通过查阅文献[22-24]及结果分析初步鉴定该反应在酯化过程中产生甘油三酯(TAG)和1,3-甘油二酯(1,3-DAG)。经弗洛里硅土法分提甘油三酯及甘油二酯，提纯前后甘油二酯的核磁共振谱图如图6所示，提纯前后，甘油三酯摩尔含量从27.50%变为9.21%，1,3-DAG摩尔含量从72.50%变为90.79%。酯化产物中甘油三酯(TAG)特征峰与1,3-甘油二酯(1,3-DAG)特征峰核磁共振氢谱谱峰归属见表1。反应产物中杂质微小可忽略不计，故总含量可视为甘油三酯和1,3-DAG含量之和。

表1 各特征峰的核磁共振信号分配Table 1 Nuclear magnetic resonance signal distribution of each characteristic peak

图6 提纯前、后甘油二酯的核磁共振氢谱图

2.4 核磁共振氢谱(1H-NMR)归属峰及计算方法的确认

牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯核磁共振氢谱图见图7，各峰的归属见表2。对图7及表2进行分析，分别按式(3)～式(5)计算油脂中油基(O)、亚油基(L)和饱和酰基(S)比例[25]：

表2 牛油核磁共振氢谱中各峰的归属Table 2 Assignment of peaks in nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of beef tallow

(3)

(4)

(5)

式中：

αD——信号峰D的面积；

αE——信号峰E的面积；

αF——信号峰F的面积。

2.5 脂肪酸组成

根据图7的各功能团信号峰位置，按式(3)～式(5)进行计算，原料牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯的脂肪酸组成变化见表3。由表3可知，与原料牛油相比，牛油脂肪酸乙酯中亚油酸、油酸含量分别降低了8.02%，2.34%，饱和程度上升了2.85%。试验制备的延黄牛脂甘油二酯中亚油酸、油酸含量分别升高了13.65%，6.47%，饱和度降低了7.17%。特异性脂肪酶RM IM制备甘油二酯时，不饱和脂肪酸乙酯干扰了饱和脂肪酸乙酯与甘油的结合，使甘油二酯中饱和度降低。从牛脂制备的甘油二酯的脂肪酸组成及结构特性可以看出，其能发挥亚油酸和油酸的功效，具有原油的营养特性，并且是一种可替代传统火锅底料油的健康油品。

图7 牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯核磁共振氢谱图Figure 7 Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of beef tallow, fatty acid ethyl ester and diacylglycerol

表3 原料牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯的脂肪酸组成†Table 3 The fatty acid composition of beef tallow, fatty acid ethyl ester of beef tallow and diglyceride %

3 结论

利用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM成功地合成了富含1,3-甘油二酯的目标产物。在固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量1%，底物摩尔比(n脂肪酸乙酯∶n甘油)2∶1，反应时间6 h，反应温度50 ℃条件下，1，3-甘油二酯生成率为72.5%、甘油三酯得率为77%，且反应对1,3-甘油二酯和甘油三酯的摩尔含量无影响；经弗罗里硅土吸附法提纯，目标产物中的1,3-甘油二酯摩尔含量可达90.79%，可以用于生产高纯度1,3-甘油二酯；经脂肪酸组成分析牛脂制备甘油二酯不仅改变其结构特性，还能降低饱和脂肪酸含量。1,3-甘油二酯为公认安全的食品成分，其精炼过程及功能安全性测定有待进一步研究。