生物基极性非质子溶剂/对甲苯磺酸耦合体系中竹粉定向解聚研究

尹小燕， 蔡婷婷， 刘 超， 蒋剑春， 王 奎*

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042；2.南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210037)

通过高效预处理等生物炼制过程，将木质纤维类生物质转化为高附加值的生物基液体燃料和化学品具有重要的意义[1]。常用的预处理方法有传统溶剂(醇、酮、酚、酸、碱等)法和新型绿色溶剂(离子液体、低共熔溶剂等)法[2]，传统溶剂具有生理毒性较高、饱和蒸气压高、分离选择性差和难以回收利用等缺点；而离子液体和低共熔溶剂体系则存在产物分离成本高、溶剂回收难度大等问题，因此相关预处理工艺环保和经济性不佳，难以大规模推广应用[3]。受石油炼制工业中芳烃萃取剂环丁砜的启发，生物基极性非质子溶剂γ-戊内酯(GVL)和二氢左旋葡萄糖酮(Cyrene)等具有木质素选择性好、饱和蒸气压低、热化学稳定性高，且生理毒性低等优点[4-6]，受到生物质炼制领域的广泛关注。GVL可以从木质纤维中的纤维素和半纤维素转化而来[7]，而Cyrene可由纤维素解聚合成的左旋葡萄糖酮加氢制备[8]。从溶解度参数看，两种生物基极性非质子溶剂均具有较好的木质素溶解能力，可选择性地分离木质纤维原料中的木质素组分，被认为是有毒的极性非质子溶剂(如N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺等)更绿色、更安全的替代品[9-10]。选取廉价的芳香性有机酸对甲苯磺酸水溶液(TsOH aq)作水相体系，可以构建能在温和条件下溶解木质素和半纤维素的极性非质子溶剂/对甲苯磺酸溶液体系[11-12]。本研究构建了GVL/TsOH aq和Cyrene/TsOH aq两种耦合溶剂体系，探讨了两种耦合体系中预处理过程对毛竹组分分离效率及其酶解糖化的影响；确定了两种溶剂体系的最佳预处理工艺，对比了最佳工艺条件下两种绿色生物基极性非质子溶剂/对甲苯磺酸耦合体系的定向解聚效果和酶解效率，旨在为探索可持续、低成本的预处理技术提供新的思路。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

毛竹，取自浙江杭州郊区，经自然干燥、粉碎、研磨后过筛，得粒径≤0.125 mm竹粉，并将竹粉在105 ℃下干燥24 h后放入干燥器中保存。原料成分分析发现:毛竹含纤维素40.3%、半纤维素26.2%、木质素29.2%、灰分1.1%及其他3.2%。

γ-戊内酯(GVL)和单糖标准品，上海阿拉丁生化科技有限公司；微晶纤维素，国药集团化学试剂有限公司；二氢左旋葡萄糖酮(Cyrene)和纤维素酶(Cellic@CTec2，Novozymes, 160 FPU/g)，Sigma-Aldrich公司；对甲苯磺酸(TsOH)，山东西亚化工有限公司。所有试剂和去离子水均未进一步纯化。

Waters E2695高效液相色谱(HPLC)仪，美国Waters公司；Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱，美国伯乐公司；3400-1型扫描电子显微镜(SEM)，日本Hitachi公司；D8型X射线衍射(XRD)仪，德国Bruker公司；iS10型傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪，美国Nicolet公司；409PC型同步热分析仪，德国Netzsch公司。

1.2 预处理过程

1.2.1γ-戊内酯/对甲苯磺酸水溶液耦合体系 称取6 g干毛竹粉加入内衬为石英材质的高压反应釜中，加入60 mL的GVL/TsOH水溶液(GVL/TsOH aq,体积比9 ∶1～0.25 ∶1)，TsOH质量浓度为40～100 g/L，在60～150 ℃下预处理20～100 min。保温结束后，取出反应釜并冷却至室温。将所得反应液进行真空抽滤，并用去离子水洗涤固体至中性，分别收集滤液和固体样品。固体样品放入105 ℃的烘箱中干燥12 h，于干燥器中冷却并保存，用于化学成分分析、理化性质表征和酶解。

1.2.2二氢左旋葡萄糖酮/对甲苯磺酸水溶液耦合体系 称取6 g干毛竹粉加入内衬为石英材质的高压反应釜中，加入60 mL的Cyrene/TsOH aq。Cyrene与TsOH aq的体积比为1.6 ∶1～0.4 ∶1，TsOH质量浓度为10～50 g/L，在100～130 ℃条件下预处理30～90 min。剩余操作方法同1.2.1节。

1.3 酶水解反应

称取干质量为1.00 g的上述2种预处理后固体样品和毛竹原料分别置于100 mL水解瓶中，加入50 mL pH值为4.8的50 mmol/L醋酸钠缓冲液，将其放进50 ℃的恒温振荡箱中预热20 min。预热结束后向其中各加入25 FPU/g纤维素酶并在50 ℃和150 r/min条件下酶水解72 h。酶解结束后，将水解瓶置于沸水浴中煮沸20 min，使残余纤维素酶失活。酶水解期间，每12 h用高效液相色谱仪测定酶水解液中葡萄糖含量。

1.4 组分分析与结构表征

1.4.1成分分析 毛竹原料及预处理后样品的纤维素、半纤维素、木质素及其他成分含量根据美国国家可再生能源实验室的两步酸水解方法进行分析。采用Waters E2695高效液相色谱仪测量水解液中糖含量，色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)，柱温55 ℃，5 mmol/L H2SO4作为流动相，流速为0.6 mL/min，进样量为10 μL，用示差检测器检测。用紫外分光光度计(λ=205 nm)测定酸水解液中可溶性木质素的含量。

1.4.2样品表征 采用SEM观察原料和预处理后样品微观形貌；通过XRD对原料和样品进行结构表征并计算结晶度，扫描范围为10～60°，速率为5°/min；采用FT-IR测定原料和样品的官能团，测试范围为4000～500 cm-1，分辨率高于0.4 cm-1，波数精度高于0.01 cm-1；利用同步热分析仪对原料和样品进行热重分析，升温速率为10 ℃/min，温度范围为40～800 ℃，保护气为N2。

1.4.3计算方法 预处理后固体样品中纤维素保留率(RC，%)、木质素分离率(SL，%)、半纤维素分离率(SH，%)、酶解葡萄糖产率(YG，%)和结晶度(ICr，%)的计算公式如式(1)～(5)所示：

RC=mCG/mRG×100%

(1)

SL=(1-mCL/mRL)×100%

(2)

SH=(1-mCH/mRH)×100%

(3)

YG=m2/m1×100%

(4)

ICr=(I002-Iam)/I002×100%

(5)

式中：mCG—预处理后固体样品中葡聚糖的质量，g；mRG—原料中葡聚糖的质量，g；mCL—预处理后固体样品中木质素的质量，g；mRL—原料中木质素的质量，g；mCH—预处理后固体样品中木聚糖的质量，g；mRH—原料中木聚糖的质量，g；m1—预处理后固体样品的质量，g；m2—预处理后固体样品经酶水解后所得葡萄糖的质量，g；I002—002结晶区的最大衍射强度，2θ=22°附近的极大峰值；Iam—非结区衍射的散射强度，2θ=18.2°附近的极小吸收峰。

2 结果与讨论

2.1 不同耦合体系的最佳预处理工艺探究

2.1.1γ-戊内酯/对甲苯磺酸水溶液耦合体系 图1(a)为GVL/TsOH aq的体积比为4 ∶1，温度为130 ℃，预处理时间为60 min时，TsOH质量浓度对GVL/TsOH aq体系中纤维素保留率，以及半纤维素和木质素分离率的影响。由图可知，随着TsOH质量浓度的增加，纤维素保留率、半纤维素和木质素分离率均先增加后降低，在75 g/L时纤维素保留率、半纤维素和木质素分离率均达到最大值，分别为91.5%、 98.5% 和98.4%。但是随着TsOH质量浓度继续增加，特别是超过90 g/L时，纤维素保留率和木质素分离率明显降低，这是因为高浓度的酸会加大对木质纤维结构的破坏，加大对纤维素的溶解，同时所溶解的木质素会重新聚合并附着在样品表面，从而使所得固体样品中木质素含量增加，不利于木质素的分离和纤维素的保留。TsOH质量浓度为75 g/L，温度为130 ℃，预处理时间为60 min时，溶剂体积比对预处理效果的影响可见图1(b)。由图可知，在GVL/TsOH aq体系中随着GVL/TsOH aq体积比的增加，半纤维素和木质素的分离率先增加后降低，但纤维素保留率没有受到较大影响。当GVL/TsOH aq体积比为4 ∶1时，半纤维素和木质素分离率达到最大，此时纤维素保留率仍然大于91%。溶剂比小于0.5 ∶1时，半纤维素和木质素分离率直线下降，其中木质素分离率降低最多，验证了GVL具有溶解半纤维素和木质素的作用。

图1(c)为GVL/TsOH aq的体积比为4 ∶1，TsOH质量浓度为75 g/L，预处理时间为60 min时，反应温度对GVL/TsOH aq体系中纤维素保留率、半纤维素和木质素分离率的影响。由图可知，随着预处理温度的升高，半纤维素和木质素的分离率先显著提高，130 ℃后趋于平缓。而纤维素保留率与预处理温度呈负相关，升高反应温度不利于纤维素保留，130 ℃后纤维素保留率开始明显降低。这也证实了过高的反应温度会对纤维素造成不可逆转的不利影响[5]，因此130 ℃为GVL/TsOH aq体系最佳预处理温度。图1(d)为GVL/TsOH aq的体积比为4 ∶1，TsOH质量浓度为75 g/L，温度为130 ℃时，反应时间对预处理效果的影响。由图可知，预处理时间对纤维素保留率和木质素分离率影响不大，但延长反应时间有利于半纤维素分离。当预处理时间为60 min时，纤维素保留率和半纤维素分离率达到最大值，同时木质素分离率大于98%。

a.TsOH质量浓度mass concn. of TsOH； b.V(GVL)/V(TsOH aq)； c.反应温度reaction temp.； d.反应时间reaction time

2.1.2二氢左旋葡萄糖酮/对甲苯磺酸水溶液耦合体系 在Cyrene/TsOH aq溶剂体积比为0.8 ∶1、预处理温度为120 ℃和预处理时间为60 min时，改变TsOH质量浓度，考察其对毛竹化学成分的影响，结果见图2(a)。由图可知，随着TsOH质量浓度的增加，纤维素保留率先提高后降低，在TsOH质量浓度为30 g/L时达到最高，而半纤维素和木质素分离率都得到不同程度的提高，再考虑到温和反应条件，因此选择30 g/L为最佳TsOH质量浓度。图2(b)为Cyrene/TsOH aq体积比对预处理的影响(TsOH质量浓度为30 g/L，温度为120 ℃，预处理时间为60 min)。由图可知，增加体积比值利于木质素的分离。在Cyrene/TsOH aq体积比0.8 ∶1时，纤维素保留率达到最高值，为87.3%，此时半纤维素和木质素分离率分别为85.5%和79.4%。图2(c)为Cyrene/TsOH aq体系中反应温度对纤维素保留率，以及半纤维素和木质素分离率的影响(Cyrene/TsOH aq的体积比为0.8 ∶1，TsOH质量浓度为30 g/L，预处理时间为60 min)。由图可知，随着反应温度的升高，半纤维素和木质素分离率都不同程度地提高，但纤维素保留率先增加后降低，在120 ℃时达到最大值，因此选择120 ℃作为最佳预处理温度。图2(d)为反应时间对预处理效果的影响(Cyrene/TsOH aq溶剂体积比为0.8 ∶1，TsOH质量浓度为30 g/L和预处理温度为120 ℃)。由图可知，随着反应时间的延长，纤维素保留率和木质素分离率均先增加后降低，而半纤维素分离率与之相反。在60 min时，纤维素保留率和木质素分离率均达到最大值，分别为87.3%和79.4%，半纤维素的分离率也在85%以上。

a.TsOH质量浓度mass concn. of TsOH； b.V(Cyrene)/V(TsOH aq)； c.反应温度reaction temp.； d.反应时间reaction time

2.2 两种耦合体系预处理效果对比

从2.1.1和2.1.2节的结果分析得出不同溶剂体系最佳预处理工艺和预处理效果，对比结果见表1，经GVL/TsOH aq和Gyrene/TsOH aq体系预处理后得到的固体样品分别标记为No.1和No.2。2种体系相比，GVL/TsOH aq体系的半纤维素和木质素分离率均高于Cyrene/TsOH aq体系；且GVL/TsOH aq体系中纤维素保留率也更高；表明GVL/TsOH aq体系更有利于半纤维素和木质素的分离以及纤维素的保留。此时，GVL/TsOH aq体系中纤维素、半纤维素和木质素质量分数分别为95.0%、 1.0%和1.2%；Cyrene/TsOH aq体系中纤维素、半纤维素和木质素质量分数分别为70.6%、 7.6%和12.1%。此外，Cyrene/TsOH aq体系的预处理工艺条件比较温和(30 g/L的对甲苯磺酸质量浓度，0.8 ∶1的溶剂比，120 ℃和60 min)，但如果继续提高反应条件，会使Cyrene/TsOH aq体系的黏度增大，不利于实验操作。GVL/TsOH aq体系不会存在黏度变大问题，能在较温和条件下(75 g/L的对甲苯磺酸质量浓度，4 ∶1 的溶剂比，130 ℃和60 min)得到比较理想的预处理效果。

表1 不同溶剂体系最佳预处理工艺和预处理效果

2.3 最佳工艺条件下预处理后固体样品的表征

2.3.1SEM分析 图3为原料及其在两种体系中预处理后固体样品的SEM图。

a.原料raw material； b.No.2； c.No.1

从图3(a)可看出，毛竹原料纤维排列紧密，表面光滑并附着少许薄纤维素片。经过Cyrene/TsOH aq 体系预处理后，从图3(b)可看出，毛竹纤维变得疏松，出现一些分层，一些纤维薄片因被溶解而消失，表明无定形的半纤维素和木质素被大部分分离，纤维素也有微量溶解。图3(c)可看出，在GVL/TsOH aq体系中原料经预处理后，表面明显粗糙，有大量分层出现，表明绝大部分半纤维素和木质素得到分离，由于纤维素具有一定的结晶度，只有少许溶解。由此可知，GVL/TsOH aq体系能有效破坏木质纤维紧密结构，很大程度地分离无定形的半纤维素和木质素，保留含有大量结晶区的纤维素。

a.原料raw material; b.No.2; c.No.1; d.MCC图4 不同样品的XRD图Fig.4 XRD patterns of different samples

2.3.2XRD分析 为研究GVL/TsOH aq和Cyrene/TsOH aq体系对纤维结晶行为的影响，将毛竹原料、微晶纤维素(MCC)和两种溶剂体系预处理后的固体样品进行XRD分析，结果见图4。由图4可知，4种样品均在2θ为15.6°、 22°和34.5°左右处出现尖锐峰，这些峰是纤维素Ⅰ型晶面的特征峰，表明两种溶剂预处理后的固体样品具有典型的纤维素Ⅰ型结构，且结晶结构没有受到破坏[13-14]。纤维素结晶度计算结果显示，毛竹原料纤维素结晶度为52.05%，经过Cyrene/TsOH aq体系预处理后纤维素结晶度达到61.13%，说明经过预处理后无定形区域的半纤维素和木质素得到有效分离。另一方面，经GVL/TsOH aq体系预处理所得固体样品的纤维素结晶度高达68.27%，更加接近微晶纤维素的结晶度(76.68%)，与原料和Cyrene/TsOH aq体系预处理后固体样品的结晶度相比，其纤维素结晶度增加显著，表明GVL/TsOH aq体系分离木质素和半纤维素的效果明显优于Cyrene/TsOH aq体系。同时GVL/TsOH aq体系的3个特征峰比原料和Cyrene/TsOH aq体系的更窄，其XRD曲线更类似微晶纤维素，表明与Cyrene/TsOH aq体系相比，GVL/TsOH aq体系在分离无定形半纤维素和木质素方面性能更优异。

1.原料raw material; 2.No.2; 3.No.1; 4.MCC

另外，GVL/TsOH aq和Cyrene/TsOH aq体系预处理后的样品在3282 cm-1附近出现了另一个明显的吸收峰，源于分子内和分子间的氢键[15,18]。为定性3800～3000 cm-1范围内O—H存在形式，对此区域进行高斯拟合，结果如图5(b)所示。由分峰拟合结果可知，两种O—H伸缩振动分别源于游离O—H和氢键O—H[19]，经GVL/TsOH aq体系预处理的样品，其暴露的游离O—H(81.9%)多于Cyrene/TsOH aq 体系预处理的样品(75.5%)，可能有助于后续的酶解糖化。

2.3.4TG/DTG分析 图6(a)和(b)分别为原料、两种溶剂体系预处理后固体样品和微晶纤维素的TG和DTG曲线。由图可知，4个样品的热失重过程均表现为3个阶段，分别为脱水、热解和炭化[20]。其中，GVL/TsOH aq体系预处理所得样品的TG和DTG曲线与微晶纤维素的非常相似，表明其预处理得到的样品性能较好，同时也表明GVL/TsOH aq体系的预处理效果优于Cyrene/TsOH aq体系。

2.4 两种体系预处理对酶解葡萄糖产率的影响

为进一步对比两种溶剂体系预处理的差异，将原料和最佳工艺条件下两种溶剂体系预处理后所得固体样品在相同的纤维素酶、酶用量和酶解条件下进行72 h酶解，不同样品的葡萄糖产率随时间变化如图7所示。

图6 不同样品的TG(a)和DTG(b)曲线图

由图7可看出，未经预处理的毛竹原料葡萄糖得率低，酶解72 h后葡萄糖产率仅为40 mg/g，这主要是因为毛竹原料的结构紧密，半纤维素和木质素包裹着纤维素，不利于纤维素酶的有效吸附。经Cyrene/TsOH aq体系预处理的样品，通过72 h 的酶解，葡萄糖产率可达306 mg/g；而经GVL/TsOH aq体系预处理的样品在同样条件下，葡萄糖产率高达773 mg/g，表明GVL/TsOH aq体系预处理效果优于Cyrene/TsOH aq体系。

2.5 溶剂的回收利用

从可持续发展战略出发，绿色溶剂应具有良好的可回收性。通过实验发现，所用溶剂体系可通过真空减压蒸馏进行回收利用。溶剂体系循环使用时，随着体系中残余的木质素降解物累积，导致木质素的分离率出现不同程度的下降。GVL/TsOH aq体系经过3次循环使用后，木质素的分离率仍在90.3%以上，半纤维素的分离率不低于91.3%，同时纤维素保留率不低于91.5%，能回收94.8%的溶剂。

3 结 论

3.1构建了两种生物基极性非质子溶剂/对甲苯磺酸水溶液(TsOH aq)耦合体系，即γ-戊内酯(GVL)/TsOH aq和二氢左旋葡萄糖酮(Cyrene)/TsOH aq体系，确定了两种溶剂体系中毛竹定向解聚的最佳预处理工艺：在体积比为4 ∶1的GVL/TsOH aq体系中，TsOH溶液质量浓度75 g/L，130 ℃下预处理毛竹粉60 min，纤维素保留率为91.5%，木质素和半纤维素的分离率分别高达98.4%和98.5%，此时预处理后固体样品的酶解葡萄糖产率高达773 mg/g；在体积比为0.8 ∶1的Cyrene/TsOH aq体系中，TsOH溶液质量浓度30 g/L，120 ℃下预处理毛竹粉60 min后，纤维素保留率可达87.3%，木质素和半纤维素分离率达到79.4%和85.5%，预处理后固体样品酶解葡萄糖产率为306 mg/g。

3.2预处理后固体样品的表征分析结果表明：相比于Cyrene/TsOH aq体系，竹粉经GVL/TsOH aq预处理后的样品木质纤维致密结构被有效破坏，结晶度达68.27%，结构更接近于微晶纤维素，同时暴露出更多的游离羟基(81.9%)，有利于后续酶解糖化过程。

3.3两种溶剂体系均可通过真空减压蒸馏的方式高效回收，并能有效重复利用。其中，GVL/TsOH aq体系经过3次循环使用后，木质素分离率仍在90.3%以上，半纤维素的分离率不低于91.3%，同时纤维素保留率不低于91.5%，能回收94.8%的溶剂。