丹酚酸B对VaD大鼠空间记忆及海马区PSD95突触相关蛋白影响

李小楠 舒刚明 高畅 张云霞 张莹

(解放军总医院第四医学中心干二科，北京 100081)

血管性痴呆(Vascular dementia,VaD)的主要病因是由脑血管疾病如：高血压、糖尿病和全身性动脉硬化等引起慢性脑缺血(Chronic cerebral hypoperfusion, CCH)导致的认知功能损害[1-2]。CCH会降低脑神经元能量，导致神经退行性病变，同时激活小胶质细胞产生活性氧和促炎性细胞因子，这些细胞因子反过来又损害神经细胞，导致脑损伤认知能力下降[3]。因此，CCH在VaD的发病机制中起着重要作用，目前双侧颈动脉闭塞引起的CCH已广泛用于VaD模型。 丹酚酸B(Salvianolic acid B，SalB)是丹参主要的水溶性组分之一，具有抗炎和抗氧化活性等多种药理作用。SalB对心肌梗死、高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病和神经系统疾病具有保护作用[4]。SalB具有调节糖尿病大鼠、肥胖大鼠糖脂代谢的作用[5]。然而，目前关于SalB对大鼠认知功能作用的研究鲜少。本实验通过Morris实验观察SalB对VaD大鼠空间记忆的影响，同时检测大鼠海马组织中PSD95、NR2A/B和PSD93等突触相关蛋白表达水平，探讨SalB对VaD大鼠学习记忆障碍的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 SalB(上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98% )；DCFH-DA(美国，Sigma公司)；丙二醛检测试剂盒和乳酸脱氢酶检测试剂盒(南京建工科技有限公司)。Nissl染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；多克隆抗体PSD95(1∶1000)、多克隆抗体PSD93(1∶1000)和多克隆抗体NR2B(美国，Bioworld Technology Inc公司)。磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(p-CREB)(1∶1000)和总CREB(t-CREB)(1∶1000)(美国，Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.2 动物分组 60只雄性Wistar大鼠，体质量(220±10) g，购自军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号为 SCXK(军)2016-0002，于室温下，在12/12 h的光/暗循环(上午8∶00灯亮)，自由获取食物和水。将大鼠随机分为4组：假手术组、模型组、治疗组(SalB 20 mg/kg)、尼麦角林组(7 mg/kg尼麦角林，阳性对照)，每组15只。本实验大鼠的处理符合动物伦理要求，并经医院伦理委员会审核同意。

1.3 动物模型制备 模型组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定在手术台上，除去颈部毛，暴露双侧颈总动脉，使用动脉夹夹住双侧颈总动脉，阻断颈总动脉血流10 min，灌通10 min后，再夹闭阻断10 min。血流再通后撤线，所有的肌肉和腺体都被引导回原位，切口缝合后放回笼中饲养。假手术组接受相同的手术，无双侧颈总动脉闭塞。治疗组及尼麦角林组均按上述模型组方法建模，术后第7天，治疗组每天灌胃SalB 20 mg/kg，尼麦角林组每天灌胃尼麦角林7 mg/kg，假手术组和模型组给予同体积生理盐水，均连续治疗6周。

1.4 水迷宫试验 迷宫是一个直径150 cm、高50 cm的圆形水池，它被分成四个想象的象限，水温20～21℃。大鼠经过训练，在西南象限找到一个淹没在1～2 cm水中的平台。在每个试验中，给大鼠最长60 s的时间来寻找隐藏的平台，并允许其在平台上停留，每天进行4个间隔试验，连续5 d测试。用MT-200 Morris水迷宫视频分析系统自动记录各组大鼠的穿越站台次数(1 min内)、站台象限停留时间、上台潜伏期和上台总路程以评价其学习记忆能力。

1.5 SalB对海马组织氧化损伤的影响 行为学试验后，每组取6只大鼠处死，取出海马组织，用PBS缓冲液(pH7.4)研磨成10%的组织匀浆，4℃离心10 min，然后根据酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒说明，收集上清液用于检测丙二醛(MDA)含量和乳酸脱氢酶(LDH)水平。使用DCFH-DA法测量活性氧(ROS)含量。

1.6 尼氏染色法观察海马区形态变化 行为学测试后，每组选取6只大鼠处死，将含有海马的中段脑组织置于10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片，二甲苯脱蜡至水，经Nissl染色(50℃下于甲苯胺蓝溶液中染色30 min)，蒸馏水冲洗，1% HCL乙醇分化30 s，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下拍照，观察大鼠海马组织CA1区神经元形态。

1.7 透射电镜观察海马区超微结构 各组随机选取2只大鼠，经腹腔麻醉后，断头，在冰上快速分离海马，切取1 mm3海马CAl区组织块，2.5%戊二醛溶液4℃固定24 h，按常规制作电镜标本，以透射电镜观察海马CA1区超微结构改变。

1.8 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马中记忆相关蛋白水平 行为学测试后，每组选取6只大鼠处死，取出海马组织，加入RIPA裂解液制备组织匀浆，4℃离心取上清(蛋白提取液)，分装后-20℃保存。使用BCA试剂盒测量蛋白质浓度后，煮沸10 min，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移到硝化纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭，一抗(NR2A/B，PSD95、PSD93、p-CREB、t-CREB和β-actin)4℃孵育过夜，将膜清洗3次，然后二抗室温孵育2 h。通过凝胶图像分析系统Quantity one对蛋白质条带进行定量分析，目的蛋白相对表达量=目的蛋白IOD值/内参β-actin IOD值，以假手术组相对表达量为100%。

2 结果

2.1 SalB对各组大鼠空间记忆障碍影响 与假手术组比较，模型组大鼠穿越站台次数下降、上台潜伏期和上台总路程增加(P<0.05)；与模型组比较，治疗组或尼麦角林组穿越站台次数增加、上台潜伏期和上台总路程下降(P<0.05)；各组大鼠站台象限停留时间无明显差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠水迷宫试验指标比较

2.2 各组大鼠海马组织中氧化应激指标水平变化 与假手术组比较，模型组MDA、LDH和ROS水平显著升高(均P<0.01)。经SalB治疗后，大鼠MDA、LDH和ROS水平均明显下降(P<0.05)。而假手术组和尼麦角林组间各指标水平无明显差异(P>0.05)，见图1。

图1 SalB对各组大鼠海马组织氧化应激的影响

2.3 各组大鼠脑组织中海马区形态变化 尼氏染色法观察显示，假手术组海马神经元形态正常，排列整齐，胞体完整，界线清晰。模型组海马区神经元丢失明显，数量减少，排列紊乱、松散，尼氏小体数量减少、体积固缩。治疗组和尼麦角林组神经元排列较为整齐，大部分细胞轮廓清晰，但仍可见少量固缩不规则细胞，见图2。

图2 各组大鼠海马CA1区尼氏染色(200×)

2.4 透射电镜观察海马区超微结构 与假手术组相比，模型组大鼠突触凹型、数量减少，活性带长度缩短，突触变的平坦；与模型组相比，经SalB治疗后大鼠突触凹型、数量增加，活性带长度增加，突触变得弯曲，与尼麦角林组基本相似，见图3。

图3 各组大鼠海马CA1区超微电镜(30000×)

2.5 SalB对各组大鼠海马组织中突触蛋白影响 Western blot检测显示，与假手术组比较，模型组PSD95、NR2A/B、PSD93蛋白水平及p-CREB/t-CREB比值明显降低(均P<0.01)；经SalB治疗后PSD95、NR2A/B和PSD93蛋白水平及p-CREB/t-CREB比值较模型组明显上升(均P<0.01)。而假手术组与尼麦角林组比较，各蛋白水平无明显差异(P>0.05)，见图4。

图4 SalB对各组大鼠海马组织中突触相关蛋白影响

3 讨论

VaD通常被认为是由脑内血管疾病引起的记忆及其他脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征[6]，也是继阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)之后第2位最常见的痴呆原因[7]，被称为“二十一世纪无声的流行病”。尽管VaD患者常出现与AD患者相似的症状，但VaD患者大脑中的相关变化并非归因于 AD的病理学，而是大脑内血流的慢性减少。

SalB生物毒性低，具有抗氧化活性，在体内能够保护血脑屏障免遭缺血再灌注损伤的影响，促进神经发生、血管再生，已被用于心脑血管疾病的治疗[8-10]。但目前还没有关于SalB改善大鼠认知功能作用的研究报道，因此本研究通过建立大鼠脑缺血再灌注模型，观察SalB对改善大鼠认知的作用效果，并探究其可能机制。

文献报道，SalB可以减轻创伤性脑损伤和Aβ25-35肽诱导的AD小鼠的认知能力下降[11]。若SalB能改善CCH所致的认知功能障碍，将可能成为VaD的治疗药物。本研究水迷宫试验显示，与模型组比较，治疗组或尼麦角林组穿越站台次数增加，上台潜伏期和上台总路程下降，说明SalB治疗能够缓解大鼠的空间记忆缺陷，这为SalB可能用于治疗CCH相关性痴呆记忆障碍提供了直接证据；尼氏染色观察显示，与假手术组相比，模型组海马区锥体细胞丢失明显，细胞层数和数量减少，提示VaD大鼠模型制作成功。治疗组和尼麦角林组排列较为整齐、细胞轮廓清晰，说明SalB具有促进VaD大鼠海马区神经细胞再生作用。

CHH被认为是VaD的一个危险因素，与ROS的产生密切相关[9,12]。氧化应激是促氧化剂与抗氧化剂内环境平衡失调，导致组织损害[13]。研究表明，CHH可诱导产生大量ROS，引起氧化应激反应，造成细胞损伤[10]，因此抑制氧化应激可能是VaD潜在治疗方法。研究报道[14]，SalB可以减少氧化应激，对大鼠肝损伤起到保护作用。本研究中，ELISA和DCFH-DA法检测发现模型组MDA、LDH和ROS水平均高于假手术组，提示大脑中的氧化应激可能会导致神经系统的功能障碍，包括记忆丧失。而经SalB治疗后，大鼠MDA、LDH和ROS水平下降，说明丹酚酸B可能通过抑制海马组织中氧化应激反应，减轻CCH大鼠的记忆障碍，从而发挥神经保护作用。

在AD及非AD痴呆患者脑中，突触和突触蛋白的丢失起着重要作用[15-18]。VaD患者颞叶皮质突触前蛋白显著减少(包括SNAP-25显著减少)[19]。NMDA受体是介导突触可塑性的主要突触后谷氨酸受体[20]，NR2A/B为NMDA受体亚单位，而PSD93和PSD95是突触后膜的关键组成部分。CREB是细胞内重要的转录因子，Ser133处CREB的磷酸化被认为是记忆过程的关键，继而激活相应基因的启动子、调节基因转录表达[21]。透射电镜观察发现，模型组大鼠突触凹型、数量减少，活性带长度缩短，突触变的平坦，同时Western blot检测显示，与假手术组相比，模型组PSD95、NR2A/B和PSD93蛋白水平及p-CREB/ t-CREB比值均降低，提示当发生VaD时大鼠海马突触蛋白发生丢失；经SalB治疗后，PSD95、NR2A/B和PSD93蛋白水平及p-CREB/ t-CREB比值较模型组均上升，说明SalB可能通过激活p-CREB，上调PSD95、PSD93、NR2A/B的表达促进脑缺血大鼠神经突触的重塑，这与透射电镜观察发现治疗组大鼠突触数量，活性带长度增加的结果基本一致。同时，SalB对这些突触蛋白的解救作用还可以维持CCH大鼠的突触功能，减轻记忆障碍。

4 结论与启示

丹酚酸B治疗能够减轻慢性脑出血大鼠的记忆损伤，其机制可能与抑制氧化应激，恢复突触蛋白有关。本研究发现SalB对突触蛋白具有解救作用，为进一步研究奠定了基础，下一步我们将对是否有其它作用机制进行探讨。