HDAC9通过下调PDE4b表达参与调控小鼠心肌肥厚

曹腾飞 孙中新 张俊

(1.成都市第一人民医院心内科，四川 成都 610016；2.成都市第三人民医院，四川 成都 610012)

心室肥厚性重构是心力衰竭病理进展中的重要环节之一[1-2]，诸多信号通路及分子蛋白参与其中。β肾上腺素能受体通路在心脏生理及病理中均发挥重要作用[3]，其通过激活第二信使cAMP促进PKA活性增加[4]，进而磷酸化其下游底物，直接影响心肌舒缩力[5]。磷酸二酯酶(Phosphodiesterases, PDEs)能够直接降解cAMP而参与心脏功能调控[6]。现已发现PDEs共有11个亚型，其广泛参与机体生理功能调控，其中PED3和PDE4为心脏主要亚型[7]。PDE4活性被抑制与心律失常、心肌肥厚均有相关性[8]。有文献报道PDE4b基因敲除可致模型动物出现心律失常、心肌细胞肥厚及心力衰竭[9]。PDE4b在心衰心肌细胞中存在低表达情况[8-9]。然而其在心肌肥厚中的具体调控机制仍不完全清楚。基因启动子区域组蛋白乙酰化影响染色质构象，其是调控基因转录的重要方式[10-11]。乙酰化修饰由组蛋白乙酰化酶(Histone acetylase, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDACs)共同参与，动态调控基因转录[12]，HDACs酶影响靶基因启动子区域组蛋白乙酰化水平，进而抑制基因转录。心脏HDAC4、5、9为心脏中最为重要的几种组HDAC亚型[13]。已有心衰研究提示心脏总体HDACs表达及活性均有升高[13]，结合PDE4b在心衰中表达下调，因此本研究推测PDE4b的下调可能由HDACs调控介导。本研究以组蛋乙酰化调控为切入点，探讨其是否通过影响PDE4b，参与心肌重构(肥厚)的调控，为抗心室重构提供潜在治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄清洁级雄性C57小鼠18只，体重25～28 g，购于四川大学华西基础医学院动物中心，SCXK(川)2015-030。本实验小鼠的处理符合动物伦理要求，并经医院伦理委员会审核同意。

1.2 主要试剂 抗HDAC9抗体(ChIP级)，工作浓度1∶2 000；抗PDE4b，工作浓度1∶2 000；抗β-actin抗体，工作浓度1∶2 000；ChIP试剂盒(Abcam 英国)；HDAC酶活性试剂盒(HDAC Activity Fluorometric Assay kit, BioVision)；山羊抗兔及山羊抗小鼠带HRP标记的IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；BCA蛋白测定试剂盒(Pierce公司)；总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；反转录试剂盒(TaKaRa公司)；实时定量PCR试剂盒(天根生化技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分组及处理 利用耳标形式将其编号，将编号录入SPSS软件中，利用软件将编号随机分为TAC组和对照组(SHAM组)，每组9只。TAC组给予主动脉弓缩窄术(Transverse aortic constriction,TAC术)。予以4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。小鼠取仰卧位。清洁手术区域，经胸骨正中切口，暴露胸腔，分离主动脉弓，6.0丝线打活结备用，将外径0.4 mm的27-G的平头针与动脉平行放置，穿入活结内，缝合丝线扎紧后移去针头。关闭胸腔。术中有2只小鼠出现死亡。SHAM组给予假手术，将丝线放置于相同位置，但不做结扎。术后4周利用二氧化碳处死小鼠，取心脏组织备用。

1.3.2 检测小鼠心脏/体重指数 术后4周利用METTLER TOLEDO电子秤进行体重称重，单位以克(g)计；利用二氧化碳窒息处死小鼠后，立刻开胸取心脏组织，PBS溶液中充分挤压，将心腔内血液排出。剔除心房组织，将心室置于干燥灭菌纱布上，来回滚动至无水印后对心室进行称重，单位以毫克(mg)计。心脏体重指数即为心室重量/体重(mg/g)。

1.3.3 H&E染色 心脏组织取出后放入4%多聚甲醛中固定过夜，冲水后利用梯度乙醇进行脱水，石蜡包埋后进行切片，切片厚度5 μm。切片后进行H&E染色。染色封片后在光学显微镜下进行拍照。H&E染色详细实验方法参照马恒辉等[14]文献报道。

1.3.4 实时定量PCR 按照RNA提取试剂盒说明书操作进行RNA提取，逆转录得到cDNA。后进行实时定量PCR检测。BNP的上游引物序列为5′-AC TCTTGGCTAACTG-3′，下游引物序列为5′-CAGTT AGCCAAGAGT-3′，产物长度为116 bp；PDE4b的上游引物序列为5′-TAACCTTCCCTGGGTAGC-3′，下游引物序列为5′-GCTACCCAGGGAAGGTTA-3′，产物长度为152 bp；HDAC4的上游引物序列为5′-T ACCGCCTCTCCAAGACA-3′，下游引物序列为5′-T GTCTTGGAGAGGCGGTA-3′，产物长度为139 bp；HDAC5的上游引物序列为5′-AATCGTCTGGGTA GATTCG-3′,下游引物序列为5′-CGAATCTACCC AGACGATT-3′，产物长度144 bp；HDAC9的上游引物序列为5′-CCGTAGATTGGCCATTGC-3′, 下游引物序列为5′-GCAATGGCCAATCTACGG-3′，产物长度124 bp；选取β-actin作为内参基因。所得数据用Bio-RadCFX96 荧光定量PCR 仪自带基于Pfaffl 原理的相对定量数据分析软件分析。

1.3.5 检测HDAC酶活性 利用BioVision的HDAC酶活性检测试剂盒对HDACs总体活性进行检测，操作按说明书进行。

1.3.6 Western blot检测PDE4b和HDAC9蛋白 小鼠冰浴下迅速取出胎盘组织，放入PBS中清洗，尽量除去残留血液，存于液氮中备用。收集胎盘组织后，利用全蛋白提取试剂盒，24 h内提取全蛋白，BCA蛋白浓度测定后调整上样量为40 μg，点样在10%的SDS-聚丙酰胺凝胶上进行电泳后电转至0.22 μm的PVDF膜上，用封闭液稀释Ⅰ抗(1∶500)后4℃过夜，洗膜后再孵育Ⅱ抗(1∶2000稀释)，室温下孵育2 h后再洗膜后用化学发光成像，将条带输入Quantity one软件获得其吸光度，以目的蛋白/β-actin(吸光度值)来反映蛋白的相对表达量。

1.3.7 染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)实验 按照ChIP试剂盒操作进行染色质免疫共沉淀操作。

1.3.8 ChIP-qPCR检测HDAC9与PDE4b启动子结合水平 选取PDE4b 基因外显子5′端前1000 bp 序列，针对该序列设计特异性引物。引物用Primer Premier 5.0软件设计，由宝生物公司合成。PDE4b的上游引物序列为5′-ATGGTACGACGCTTCACTT CGCA-3′，下游引物序列为5′-TGCGAAGTGAAGC GTCGTACCTA-3′，产物大小为139 bp。所得数据用Bio-RadCFX96 荧光定量PCR 仪自带基于Pfaffl 原理的相对定量数据分析软件分析。

2 结果

2.1 小鼠心室/体质量比 分别称取小鼠心室重量及体重后，计算心室/体质量比(mg/g)。TAC组术后4周小鼠心室/体质量比(5.50±0.23)明显高于SHAM组(4.48±0.18)，两组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 TAC组与SHAM组小鼠心室/体质量比(n =5)

2.2 心脏组织结构 利用H&E染色后对比TAC术及SHAM术后4周心脏大体形态。左室后壁、室间隔明显增厚(图2A、2B)。200倍视野下，心肌细胞明显肥大，见图2C、2D。

图2 TAC及SHAM术后小鼠心肌细胞出现肥大

2.3 HDACs酶活性检测 HDACs酶总活性在TAC组(5.03±0.58)中明显高于SHAM组(3.24±0.32)(P<0.05)，见图3。

图3 TAC及SHAM组心脏组织中HDACs总体活性(n=5)

2.4 MYH7、PDE4b、HDAC4、HDAC5及HDAC9 mRNA 表达水平 q-PCR检测显示，与SHAM组比较，TAC组术后4周心肌肥厚标志物MYH7表达明显升高(0.91±0.04vs1.44±0.07 )(P<0.05，图4A)；PDE4b表达明显下降(0.75±0.09vs0.27±0.06)(P<0.01，图4B)；HDAC9明显升高( 0.85±0.08vs1.35±0.07)(P<0.05，图4C)；HDAC4(1.29±0.12vs1.29±0.17)及HDAC5(1.92±0.33vs2.02±0.36 ) mRNA水平两组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图4D、4E。

图4 TAC组及SHAM组心脏组织中各基因表达(n=5)

2.5 HDAC9和PDE4b蛋白表达水平 Western blot检测显示，与SHAM组比较，TAC组心脏中HDAC9蛋白显著升高(0.77±0.10vs1.25±0.05)(P<0.05，图5A)；PDE4b蛋白明显降低(0.67±0.11vsTAC 0.34±0.05)(P<0.05)，见图5B。

图5 TAC及SHAM组心脏组织中HDAC9及PDE4b蛋白表达量(n=5)

2.6 HDAC9与PDE4b启动子结合水平 与SHAM组比较，HDAC9与PDE4b启动子结合区域水平在TAC组中显著升高(1.67±0.1vs2.47±0.20，P<0.05)，见图6。

图6 HDAC9与PDE4b启动子结合水平(n=5)

3 讨论

心肌肥厚是心室肌重构的重要表现，其涉及众多信号通路紊乱及分子蛋白表达异常[15]，为心力衰竭的重要病理过程之一。其显著特点为心室，尤其是左室后壁及室间隔增厚，心肌细胞肥大。TAC是构建心肌肥厚及心力衰竭模式动物的常用技术方法，本研究结果与经典TAC小鼠术后数据相似，术后4周心脏出现明显肥厚[16]，心室/体质量指数也出现明显升高，同时心肌肥厚的重要标志物MYH7也出现表达上调[17]，提示模型构建成功。

PDE在心脏生理及病理中均发挥重要作用，由于其不同亚型的底物有所不同，因此对PDE的研究应尽可能细化。西地那非，即为PDE5抑制剂，其已经被FDA批准用于部分心血管疾病的治疗[18]。然而PDE4b作为心脏中PDE的另一个重要亚型，其在病理状态下表达与PDE5有着显著区别，有研究发现PDE4b在心肌肥厚及心衰小鼠心肌细胞中均出现表达下调[19]，最近研究在心力衰竭的人体心脏组织中也发现了其表达下降[20]。然而其在心肌肥厚及心衰中低表达的机制尚不清楚。本研究也发现在肥厚的小鼠心肌组织中，PDE4b表达明显下降。接下来，本研究将切入点放在了组蛋白乙酰化修饰上面。

作为影响基因转录表达重要表观遗传调控手段，组蛋白乙酰化调控已经为学者所熟知[21]。同时近些年不断有研究发现HDAC酶在心肌肥厚、心力衰竭发生、发展中的重要作用[22-23]。因此，本研究首先检测了HDACs酶在肥厚心肌组织中的总体活性，本研究发现HDACs酶总体活性明显升高。利用q-PCR本研究进一步发现，在肥厚心肌组织中HDAC9显著上调。提示其参与心肌肥厚发生。本研究继续利用染色质免疫共沉淀技术，探讨HDAC9上调是否参与PDE4b表达的下调。数据提示，心肌肥厚中HDAC9可直接结合于PDE4b启动子区域，进而下调其表达，然而并没有进一步利用荧光素酶报告系统设计细胞实验，探讨HDAC9与PDE4b启动子结合的具体区域，以及是否具有特异性，此为研究的局限性之一。

本研究解释了心肌肥厚中PDE4b下调的可能分子机制。组蛋白乙酰化修饰是一个可逆的过程，目前HDAC抑制剂也是心血管疾病研究的热点之一。因此，本研究结果将为心肌肥厚的干预提供潜在干预靶点。然而在这一病理过程中，是否伴随其他如PDE4a、PDE4d等亚型的变化，以及利用HDAC酶抑制剂是否能实现以PDE4b为靶点的挽救实验，仍值得我们后续关注。

4 结论

在心脏后负荷应激增加诱导的心肌肥厚中，组蛋白去乙酰化酶HDAC9可能通过调控PDE4b启动子组蛋白乙酰化水平，可能参与调控其转录表达，进而参与心肌肥厚病理进展。