芬太尼通过ILF3-AS1/miR-132对卵巢癌细胞生长和转移的影响

何含，刘群，钟庆，翁艳，汪艳，黄凡，邬瑞刚，杨国仁

卵巢癌是女性常见恶性肿瘤之一，手术是其主要治疗方式［1］。芬太尼是临床常用麻醉药，麻醉效果显著。研究发现芬太尼可能通过抑制Src 通路活化抑制鼻咽癌细胞侵袭转移［2］，芬太尼还可抑制胃癌SGC-7901 细胞增殖［3］。然而芬太尼对卵巢癌细胞作用的研究仍然缺乏。研究表明，长链非编码RNA（lncRNA）白细胞介素增强结合因子3 反义RNA1（interleukin enhancer binding factor 3 antisense RNA1，ILF3-AS1）在黑色素瘤组织中高表达，可促进黑色素瘤的增殖，迁移和侵袭［4］。微小RNA（miRNA/miR）的异常表达也与卵巢癌的发生发展密切相关，如卵巢癌组织中miR-132 低表达，过表达miR-132能够抑制卵巢癌细胞的增殖，侵袭和迁移［5］。本研究于2018 年8 月至2019 年10 月，体外培养卵巢癌细胞A2780，重点考察芬太尼是否通过ILF3-AS1和miR-132 影响卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭行为。为芬太尼能更好地应用于卵巢癌手术治疗，提高卵巢癌病人的治疗疗效提供理论及参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料卵巢癌细胞A2780购自武汉Procell Life公司；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒、双荧光素酶检测试剂盒购自北京Solarbio 公司；二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、放射免疫沉淀法（RIPA）蛋白裂解液、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒、结晶紫购自碧云天生物技术研究所；Trizol试剂、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒购自日本 Takara 公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 卵巢癌A2780 细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液中，保持在37 ℃、5%二氧化碳环境中生长。

1.2.2 细胞处理与分组 A2780 细胞用0、0.5、5、50、500 ng/mL浓度芬太尼处理A2780细胞，作为不同浓度芬太尼处理组。A2780细胞分别按照美国Invitrogen 制造的LipofectamineTM2000 试剂操作规程，进行过表达ILF3-AS1（pcDNA3.1-ILF3-AS1、对照pcDNA3.1）、抑制miR-132 表达（抗-miR-132、对照antimiR-NC）转染，8 h 后给予500 ng/mL 芬太尼，作为芬太 尼500+（pcDNA3.1、pcDNA3.1-ILF3-AS1、antimiR-NC、anti-miR-132）组。将pcDNA3.1、pcDNA3.1-ILF3-AS1、si-NC、si-ILF3-AS1 转染至A2780 细胞中，记为pcDNA3.1组、pcDNA3.1-ILF3-AS1组、si-NC组、si-ILF3-AS1组，转染48 h测量miR-132表达。

1.2.3 蛋白质印迹法（Western blotting）检测P21、E钙黏蛋白（E-cadherin）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白表达 每组A2780 细胞总蛋白应用RIPA 蛋白裂解液进行抽提，经过BCA 法定量。取60 μg 蛋白上样、SDS-PAGE 后，转聚偏二氟乙烯（PVDF）上。用5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1.5 h，分别加入相应的一抗（4 ℃）过夜：周期蛋白依赖性激酶抑制因子（P21）抗体、E-cadherin 抗体、MMP-2 抗体，随后加入二抗（室温）孵育2 h，并通过增强化学发光液进行观察，凝胶分析软件Quantity One 测定各组蛋白条带相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的灰度值。

1.2.4 MTT 检测细胞存活率 每组A2780 细胞在96 孔板中培养48 h 时，与20 μL 的MTT 溶液反应4 h，结晶以二甲基亚砜150 μL 溶解，在490 nm 处，用Thermo FC酶标仪测量吸光度（OD）值。细胞存活率（%）=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.2.5 克隆形成实验检测细胞克隆形成数 每组A2780细胞接种于六孔板（500个/孔），用完全培养基培养14 d，用甲醇固定细胞集落并用结晶紫染色30 min，在低倍光学显微镜下计数集落（＞50个细胞）。

1.2.6 Transwell 检测细胞迁移和侵袭 将600 μL RPMI-1640 完全培养液加至Transwell 下室，将无血清RPMI-1640 培养液配制的200 μL A2780 细胞悬液加入Transwell 上室。其中，细胞侵袭实验中，Transwell 的上室事先铺有100 μL 无血清RPMI-1640 培养液稀释的Matrigel，而细胞迁移实验未铺Matrigel。培养24 h后，下层细胞用多聚甲醛固定并用0.1%结晶紫染色10 min，显微镜观察、计算侵袭或迁移细胞数。

1.2.7 RT-qPCR 检 测ILF3-AS1 和miR-132 的表达水平各组A2780 细胞培养48 h，Trizol 试剂进行总RNA 提取，互补DNA（cDNA）由1 μg 总RNA 通过反转录试剂盒合成，在ABI7500 PCR 仪上通过荧光定量试剂盒进行PCR。ILF3-AS1 和miR-132 相对表达量用2-ΔΔCt法计算。引物序列（5'-3'）：ILF3-AS1 正向引物：TAAACCCCACTGTCTTCC，反向引物：TTCCTTGCTCTTCTTGCTC；lncRNA 内参GAPDH 正向引物：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，反向引物：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG；miR-132正向引物：ACCGTGGCTTTCGATTGTTA，反向引物：GGCGACCATGGCTGTAGACT；miRNA内参U6正向引物：CGCTTCGGCAGCACATATACTA，反向引物：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA。

1.2.8 荧光素酶报告实验检测ILF3-AS1 与miR-132 的靶向结合 分别合成miR-132 结合位点的ILF3-AS1 的野生型（WT）和突变型（MUT）序列，并插入荧光素酶表达载体，构建WT-ILF3-AS1 和MUT-ILF3-AS1 荧光素酶表达载体，将上述载体分别与miR-NC 或miR-132 共转染A2780 细胞。按照双荧光素酶检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法实验数据经SPSS 20.0 分析，计量资料用表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芬太尼对卵巢癌细胞A2780 增殖、迁移、侵袭的影响5 ng/mL 以上浓度芬太尼处理的卵巢癌细胞A2780 中P21、E-cadherin 表达水平比未经芬太尼处理以及0.5 ng/mL 浓度芬太尼处理的A2780 细胞逐渐升高，MMP-2 表达水平、存活率、克隆形成数、迁移、侵袭细胞数均比未经芬太尼处理以及0.5 ng/mL 浓度芬太尼处理的A2780 细胞逐渐降低（P＜0.05），见图1、图2、表1。

图2 芬太尼对P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表达的影响

表1 芬太尼对卵巢癌细胞A2780增殖、迁移、侵袭的影响/

表1 芬太尼对卵巢癌细胞A2780增殖、迁移、侵袭的影响/

注：P21为周期蛋白依赖性激酶抑制因子，E-cadherin为E钙黏蛋白，MMP-2为基质金属蛋白酶-2。①与0 ng/mL组比较，P＜0.05。②与0.5 ng/mL组比较，P＜0.05。

2.2 芬太尼对卵巢癌细胞A2780 中ILF3-AS1、miR-132 表达的影响与未经芬太尼处理以及0.5 ng/mL 浓度芬太尼处理的细胞相比，5 ng/mL 以上浓度芬太尼处理的卵巢癌细胞A2780 中ILF3-AS1 表达水平显著降低，miR-132 表达水平显著升高（P＜0.05），见表2。

表2 芬太尼对卵巢癌细胞A2780中ILF3-AS1、miR-132表达的影响/

表2 芬太尼对卵巢癌细胞A2780中ILF3-AS1、miR-132表达的影响/

注：ILF3-AS1 为白细胞介素增强结合因子3 反义RNA1，miR-132为微小RNA-132。①与0 ng/mL组比较，P＜0.05；②与0.5 ng/mL组比较，P＜0.05。

2.3 过表达ILF3-AS1能逆转芬太尼对卵巢癌细胞A2780 增殖、迁移、侵袭的抑制作用芬太尼500+pcDNA3.1-ILF3-AS1 组卵巢癌细胞A2780 中ILF3-AS1表达水平比芬太尼500+pcDNA3.1组显著升高，P21、E-cadherin 表达水平比芬太尼500+pcDNA3.1组显著降低，MMP-2 表达水平、存活率和细胞克隆形成数、迁移、侵袭细胞数也比芬太尼500+pcDNA3.1组显著升高（P＜0.05）（图3、图4、表3）。

表3 过表达ILF3-AS1能逆转芬太尼对卵巢癌细胞A2780增殖、迁移、侵袭的抑制作用/

表3 过表达ILF3-AS1能逆转芬太尼对卵巢癌细胞A2780增殖、迁移、侵袭的抑制作用/

注：ILF3-AS1 为白细胞介素增强结合因子3 反义RNA1，P21 为周期蛋白依赖性激酶抑制因子，E-cadherin 为E 钙黏蛋白，MMP-2 为基质金属蛋白酶-2。

图4 过表达ILF3-AS1能逆转芬太尼对P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表达的影响

2.4 抑制miR-132 能逆转芬太尼对卵巢癌细胞A2780 增殖、迁移、侵袭的抑制作用芬太尼500+anti-miR-132 组卵巢癌细胞A2780 中miR-132 表达水平低于芬太尼500+anti-miR-NC 组，P21、E-cadherin 表达水平也低于芬太尼500+anti-miR-NC 组，MMP-2 表达水平、存活率高于芬太尼500+anti-miRNC组，细胞克隆形成数、迁移、侵袭细胞数也高于芬太尼500+anti-miR-NC组（P＜0.05）（图5、图6、表4）。

表4 抑制miR-132能逆转芬太尼对卵巢癌细胞A2780增殖、迁移、侵袭的抑制作用/

表4 抑制miR-132能逆转芬太尼对卵巢癌细胞A2780增殖、迁移、侵袭的抑制作用/

注：miR-132为微小RNA-132，P21为周期蛋白依赖性激酶抑制因子，E-cadherin为E钙黏蛋白，MMP-2为基质金属蛋白酶-2。

图6 抑制miR-132能逆转芬太尼对P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表达的影响

2.5 ILF3-AS1 靶 向、调 控miR-132ILF3-AS1 与miR-132 的结合位点见图7。miR-132 组中WTILF3-AS1 荧光素酶活性比miR-NC 组显著降低约0.67 倍（P＜0.05）（表5）。pcDNA3.1-ILF3-AS1 组miR-132表达水平（0.22±0.02）比pcDNA3.1组（1.01±0.10）下降（P＜0.05），si-ILF3-AS1 组miR-132 表达水平（2.55±0.25）比si-NC 组（0.98±0.10）升 高（P＜0.05）。

图7 ILF3-AS1与miR-132的结合位点

表5 双荧光素酶报告实验/

表5 双荧光素酶报告实验/

注：WT-ILF3-AS1 为野生型白细胞介素增强结合因子3 反义RNA1，MUT-ILF3-AS1 为突变型白细胞介素增强结合因子3 反义RNA1。

3 讨论

芬太尼除麻醉作用外，研究显示芬太尼浓度大于5 ng/mL 时能抑制食管癌细胞的增殖和侵袭［6］，促进细胞凋亡［7］；还可通过诱导细胞凋亡抑制人乳腺癌干细胞肿瘤发生［8］。为研究芬太尼对卵巢癌的影响，本实验分别用不同浓度的芬太尼处理卵巢癌细胞A2780，结果显示，当芬太尼浓度大于5 ng/mL 时，A2780 细胞中P21、E-cadherin 上调，MMP-2 下调，细胞存活率、克隆形成数及迁移、侵袭细胞数同样减少。P21 是细胞周期负调控因子，表达增加能阻止细胞周期发展，从而抑制细胞增殖［9］。间质转化的上皮标志物E-cadherin，高表达可阻碍细胞转移；MMP-2 是基质金属蛋白酶家族成员，用于评估细胞迁移、侵袭能力［10］。说明当芬太尼浓度大于5 ng/mL时可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭。

研究发现lncRNA 在女性生殖系统恶性肿瘤中可能扮演着癌基因或抑癌基因的角色［11-13］。如敲低ILF3-AS1 可抑制骨肉瘤细胞的增殖，迁移和侵袭，并促进细胞凋亡［14］；可抑制黑素瘤细胞的增殖，迁移和侵袭［15］。且还有研究报道ILF3-AS1 与宫颈癌病人总体生存期限相关，可作为宫颈癌预后生物标志物［16］。ILF3-AS1 还可以有效区分结肠癌病人癌症复发的风险高低［17］。然而ILF3-AS1 对卵巢癌细胞的影响还尚不清楚，本实验结果显示，浓度大于5 ng/mL 芬太尼处理的细胞A2780 中ILF3-AS1 表达水平显著降低。进一步研究结果显示芬太尼处理卵巢癌细胞的同时过表达ILF3-AS1，提示，芬太尼抑制卵巢癌细胞A2780增殖、迁移、侵袭的作用被过表达ILF3-AS1 所逆转，可见芬太尼可能通过下调ILF3-AS影响卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭。

本研究结果显示证实ILF3-AS1 可靶向调控miR-132。已有研究表明miR-132 可抑制卵巢癌细胞的增殖，促进细胞凋亡［18］。miR-132 过表达还可增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，并抑制细胞的侵袭和转移［19］。而本实验发现浓度大于5 ng/mL 芬太尼处理的卵巢癌细胞A2780 中miR-132 表达水平显著升高，而抑制miR-132 能逆转芬太尼减弱卵巢癌细胞A2780增殖、迁移、侵袭的结果，因此，芬太尼对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响还与miR-132有关。

综上所述，芬太尼浓度大于5 ng/mL 时可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，其机制可能与调控ILF3-AS1/miR-132表达有关。

（本文图1，3，5见插图4-2）

图1 芬太尼对卵巢癌细胞迁移、侵袭的影响（结晶紫染色×200） 图3 过表达ILF3-AS1能逆转芬太尼对卵巢癌细胞迁移、侵袭的影响（结晶紫染色×200） 图5 抑制miR-132能逆转芬太尼对卵巢癌细胞迁移、侵袭的影响（结晶紫染色×200）