酶联免疫法测定水产苗种中氯霉素残留量

梁娟，张倩玉，魏海英，王芳，安萍，王磊

（日照市海洋与渔业研究院，山东 日照 276826）

氯霉素（chloramphenicol,CAP）作为广谱抗生素，因其生产工艺简单、价格低廉，且对革兰阴性和阳性菌等多种病原菌均有较强的预防与治疗作用，曾经被水产行业作为苗种繁育和提高养殖产量的“法宝”。但是，经研究证明，含有氯霉素的食物被人类长期食用后，会导致再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、毒血症等疾病发生，即使低浓度药物残留也会诱发致病菌的耐药性，对人体的毒副作用较大。因此，氯霉素已被大多数国家明令禁止在人类可食用的动物源性食品中使用。《中华人民共和国农业农村部公告 第250号》中规定，氯霉素在所有食品动物中禁止检出。

关于氯霉素的检测方法，气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等大型仪器分析方法，灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确认方法。然而，水产苗种的繁育季节性强、周期短，苗种今天被抽检，明天被销售的情况屡见不鲜，大型仪器分析方法前处理过程耗时较长，检测结果滞后，是水产品质量安全监管部门执法时所面临的棘手问题，成为执法工作时效性的制约因素。因此，含有氯霉素的水产苗种很容易流向市场，成为渔业质量安全监管工作中的“漏网之鱼”，而酶联免疫法检测氯霉素技术可以有效地解决这一问题，成为执法部门的有力抓手。

目前使用最普遍的酶联免疫法分析技术与大型仪器分析方法相比，除具备对人体伤害和环境污染危险性小、检出限低、灵敏度高、样品容量大、仪器化程度和分析成本低等优点外，操作简便、快速、检测结果及时、可提高执法工作的时效性更成为大型仪器分析法所不具备的优势，是目前最理想的氯霉素残留筛选性分析方法之一。日照市海洋与渔业研究院综合检测中心用酶联免疫法检测水产苗种中氯霉素残留量取得了一定的操作经验，已获得“CMA”和“CATL”资质，得到山东省市场监督管理局和山东省农业农村厅等监管部门的官方认可。现将试验情况介绍如下。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

MK3微孔板酶标仪、微量移液器、多道微量移液器（赛默飞世尔科技有限公司）；PL202-L电子精密天平（梅特勒托利多仪器上海有限公司）；TG16-WS2台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；涡旋混合器（美国Talboys公司）；DC-24水浴氮吹仪（上海安谱试验科技股份有限公司）；10 D经济型纯水仪（上海摩勒科学仪器有限公司）；DNP-9002BS-III电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；BCD-215KS海尔电冰箱（青岛海尔股份有限公司）；-10～50℃、10%～90%RH温湿度表（北京康威仪表有限责任公司）；JYL-C022九阳料理机（九阳股份有限公司）。

1.2 化学试剂

96孔氯霉素检测试剂盒（美国柏尔生物技术公司）；去离子水；分析纯乙酸乙酯（上海国药集团化学试剂有限公司）；分析纯正己烷（天津科密欧试剂有限公司）。

1.3 样品前处理

日照市海洋与渔业研究院综合检测中心提供给国家北方虾蟹产业技术体系日照站、山东省现代农业刺参产业技术体系日照综合试验站和山东省现代农业鱼类产业技术体系日照东港综合试验站氯霉素标准储备溶液，委托其用聚乙烯桶分别培育中国对虾苗种、三疣梭子蟹苗种、刺参苗种和牙鲆苗种的阳性样本作为试验对象，空白样品的样本亦由其提供。开始试验前，挑出样品中饵料等杂质，用去离子水清洗、沥干，用九阳料理机搅碎成糜状，充分混合均匀，放入冰箱2～6℃冷藏待检。

1.4 氯霉素的提取

准确称取糜状样品（3.00±0.01)g置于25 mL聚丙烯离心管中，质控样品中加入标准溶液测定加标回收率，50℃孵育30 min；加入6 mL乙酸乙酯，以最大转速涡旋振荡5 min，室温（22.5±2.5）℃，4 000 r/min离心10 min；移取4 mL乙酸乙酯上清液（相当于2.00 g原始样品），置于10 mL聚丙烯离心管中，60～70℃水浴氮气吹干。

1.5 样品净化

加入2.00 mL正己烷溶解干燥物，加入1.00 mL 1倍的样品提取液，最大转速涡旋振荡2 min；室温（22.5±2.5）℃，4 000 r/min离心10 min，去除上层正己烷层，下层溶液供酶标板进行检测。

1.6 试验方法

移取标准溶液或样品上机液100μL，置于对应的酶标板孔中；再按以上顺序加入50μL CAPHRP，轻轻振荡混匀1 min，用盖板膜盖板后，室温（22.5±2.5）℃避光孵育30 min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，每孔及时加入洗涤液250μL，轻轻振荡混匀1 min，将孔内液体甩干，重复洗板步骤3次，每次间隔10 s，在吸水纸上倒扣、排干（排干后若有气泡，先用洗耳球吹破，再拍干）；每酶标板孔加入100μL的底物（TMB Substrate），轻轻振荡混匀1 min，用盖板膜盖板后，室温（22.5±2.5）℃避光孵育15～20 min；每酶标板孔加入100μL的终止液终止反应，轻轻振荡混匀1 min，供上机测定。在上机前40～60 min打开酶标仪，使仪器状态稳定，并将测试波长设定为450 nm。

1.7 方法优化

在动物体内，氯霉素（CAP）不只是以游离形式存在，葡萄糖酸苷结合物（CAPG）是其最主要的代谢物形式。若直接用乙酸乙酯对样品进行提取，只能提取出游离态氯霉素，方法灵敏度降低。为提高方法灵敏度并防止出现假阴性结果，需要对方法进行优化改进，通过升温孵育将结合键破坏，以提高氯霉素检出浓度。为验证优化改进的可行性，该试验采取直接提取和升温孵育提取。将各试验站提供的4种不同基质阳性样品各称取2组，每组3管，分别设置直接提取和50℃孵育30 min后提取2种方法条件，以验证优化改进效果。

2 结果与分析

2.1 不同提取剂对样品的影响

美国柏尔生物技术公司生产的氯霉素检测试剂盒，提供了乙酸乙酯和乙腈2种氯霉素提取方法，但考虑到对人体的危害性和环境的污染性来说，乙腈比乙酸乙酯毒性大，再加上马永飞等比较了3种不同的提取剂（乙腈、乙酸乙酯和水）对CAP提取效果的影响，发现乙酸乙酯作为提取剂时，提取效果优于乙腈和水。因此，该试验选用乙酸乙酯作为氯霉素提取试剂。

2.2 升温孵育对检出浓度的影响

升温孵育对氯霉素残留检出浓度的影响情况见表1。表1结果显示，50℃孵育30 min后提取，氯霉素残留的平均检出浓度明显得到提高，平均提高率为12.4%～13.8%，由此可见，升温孵育适用于氯霉素的提取，故该试验将直接提取优化为升温孵育提取。

表1 升温孵育对氯霉素残留检出浓度的影响

2.3 线性范围及检出限

大型仪器分析法和酶联免疫法的线性范围见表2 ，大型仪器分析法和酶联免疫法的检出限与定量限见表3。与文献[10-11]中推荐的液相色谱-串联质谱法和气相色谱法相比，酶联免疫法检出限较低、灵敏度较高（表2、表3），可以对样本中氯霉素残留浓度进行定量判断。

表2 大型仪器分析法和酶联免疫法的线性范围

表3 大型仪器分析法和酶联免疫法的检出限与定量限

2.4 加标回收率与精密度（RSD）

对食品中禁用药物，回收率应在方法检测下限、2倍方法检测下限和10倍方法检测下限进行加标回收率试验。选取4种不同基质的氯霉素阴性样品，分别做样品添加浓度为0.025，0.050，0.250μg/kg的3个加标水平进行检测，每个加标水平平行测定6次，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD）（表4）。与大型仪器分析法的自动进样方式不同，酶联免疫分析法是手动进样。操作可调试移液器采用“吸二打一”的手法，可缩小偶然误差、增加微量进样的稳定性、确保精密度并提高加标回收率。

表4 不同基质、不同加标水平的加标回收率和相对标准偏差

2.5 基质效应

由表4可见，酶联免疫法回收率高、重复性好，虾、蟹、参、鱼各种基质苗种平均回收率测定为71.2%～113.5%，相对标准偏差测定为3.3%～9.2%，符合“70%≤加标回收率≤120%、相对标准偏差（RSD）≤10%”的质量控制规定，且灵敏度高，检测下限可达0.025μg/kg，在0.05μg/kg的低加标水平下，回收率依然可达70%～120%的质控范围，能满足为水产品质量安全执法部门筛选阳性样品的要求。

3 结论

酶联免疫法的缺点是影响因素较多，易出现大量假阳性结果，抗体批次不同，测定结果也会出现差异，但灵敏快捷、高精密度且简便易行是酶联免疫法在药物残留分析方法中的最大优势。多年来，日照市海洋与渔业研究院综合检测中心一直承担着市级水产苗种质量安全监督抽查和风险监测任务，为市级渔业主管部门的管理工作和执法检查提供强有力的技术支撑。在实际检测工作中，不可能也无必要对所有水产苗种采用各种复杂、耗时、昂贵的大型仪器分析方法，建立灵敏度高、特异性强、简便易行的酶联免疫分析法，及时为管理部门提供执法依据。