基于ASFV EP402R 编码蛋白CD2v 的生物信息学分析

张 帅，顾文源，赵云环，刘 莹，左玉柱，范京惠

（1. 河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001；2. 河北省动物疫病预防控制中心，河北 石家庄 050035；3. 河北省兽医生物技术创新中心，河北 保定 071001）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的家猪和野猪的最具破坏性的出血性传染病之一。早在撒哈拉以南非洲国家流行，2007 年传入格鲁吉亚地区，近年来，又传播到西欧和东南亚各国，2018 年传入我国后，迅速在各地猪场蔓延，给我国养猪业造成了毁灭性的打击。根据毒力大小，ASFV可分为高毒力、中毒力、低毒力和无症状感染毒株。在非洲猪瘟的临床病例中，高致病性病毒感染最为常见，发病率和死亡率可高达100%。因此，世界动物卫生组织（OIE）将ASF 列为必须报告的动物疫病，在我国也将ASF 列为一级动物疫病［1］。

ASFV 是一种结构复杂的大型、双链、线性DNA 病毒，基因组庞大，大小约为170 ～190 kb，编码超过200 种蛋白质。由于其结构的复杂性，尽管国内外学者对其进行了大量研究，大多数蛋白质的功能仍不清楚，阻碍了疫苗的研发和致病机制及免疫逃避机制的探明，导致目前尚无商品化疫苗及特效的药物用于ASF 的有效防控［2］。在编码的200多种蛋白质中，超过50 种是构成病毒结构的主要蛋白，其中由EP402R 基因编码的CD2v 蛋白是ASFV晚期表达蛋白［3］，可介导红细胞对ASFV 感染细胞的吸附作用，抑制有丝分裂原诱导的淋巴细胞增殖，延长免疫系统消灭病毒的时间，同时还是ASFV 血清型分型的关键蛋白［4］，且在机体免疫调节、免疫逃逸和ASFV 病毒入侵宿主和传播扩散中发挥重要作用。目前该蛋白的结构尚未完全解析，因此深入了解CD2v 蛋白的结构及功能，将有助于ASFV 的有效防控［5］。本研究以中国首次分离且在国内流行的非洲猪瘟病毒Pig/HLJ/2018 株为研究对象，对ASFV CD2v 蛋白进行了遗传进化分析、理化性质分析、蛋白结构和亚细胞定位预测、蛋白跨膜区和信号肽分析以及B 细胞和T 细胞抗原表位分析等生物信息学分析［6］，以期为ASFV 的进化分析和CD2v蛋白的功能研究、ASFV 与宿主细胞的作用机制研究以及疫苗研发提供一些基础性数据，为ASF 的有效防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 CD2v 蛋白遗传进化分析

通过登录NCBI 查询中国流行株Pig/HLJ/2018株（GenBank：QBH90580）ASFV EP402R 基因并选取其他国内、外具代表性的毒株20 条，获取基因组和基因型等信息（见表1），用MEGA 7.0 软件进行遗传进化树构建，描述20 种不同基因组数据之间的关系；用Megalign 软件对20 条氨基酸序列进行比较和分析。

表1 20 株ASFV EP402R 基因统计信息Table 1 Statistical information of EP402R gene of 20 ASFV strains

1.2 CD2v 蛋白理化性质分析

利用ExPASy 在线分析工具ProtParam 对CD2v蛋白的分子量、等电点、氨基酸组成、原子数、疏水性等理化性质进行分析。

1.3 CD2v 蛋白结构预测

利 用 在 线 工 具GOR4、Swiss-Model、cNLS Mapper、Psort 等分析软件对CD2v 蛋白NLS 序列和二、三级结构和亚细胞定位情况进行预测［7］。

1.4 CD2v 蛋白跨膜区和信号肽预测

通过TMHMM-2.0 在线工具分析CD2v 蛋白跨膜区［8］，通过SignalP-5.0 在线工具分析CD2v 蛋白信号肽［9］。

1.5 CD2v 蛋白B 细胞和T 细胞抗原表位分析

采用在线分析工具BepiPred 1.0、IEDB 分析序列B 细胞抗原表位区域［10］，采用NetMHC 4.0、NetMHCpan 4.1 在线服务器分析序列T 细胞抗原表位区域［11］，并结合蛋白二级结构预测中的α-螺旋、β-折叠、β-转角等不易形成抗原表位的区域，筛选出优势表位区域。

2 结果与分析

2.1 基于Pig/HLJ/2018 株ASFV CD2v 蛋白序列遗传进化分析结果

2.1.1 基于ASFV CD2v 蛋白基因EP402R 的进化树 通 过 对Pig/HLJ/2018 株ASFV 和 从NCBI 查询筛选出的ASFV CD2v 蛋白基因EP402R 序列组成20 条序列构建进化树（图1）结果显示，Pig/HLJ/2018 株 与 格 鲁 吉 亚Georgia 2007、Georgia 2008 以及其他中国毒株处于同一分支，基因组分型同为Ⅱ型，同时显示当前格鲁吉亚地区、中国、东南亚地区流行毒株均为基因Ⅱ型；西欧地区流行毒株主要为基因Ⅰ型；非洲地区当前流行毒株多为Ⅸ型和Ⅹ型，从进化关系来看，Ⅸ型和Ⅹ型具有很高的相似性［12］。

图1 20 株ASFV EP402R 基因进化树Fig.1 20 ASFV EP402R gene evolutionary tree

2.1.2 ASFV CD2v 蛋白氨基酸序列分析 通过Megalign 软件对20 条氨基酸序列进行比较和分析后结果（见图2）显示，不同基因型之间氨基酸序列存在着不同程度的突变、插入与缺失，同一基因型间氨基酸序列的一致性较高，Pig/HLJ/2018 株与格鲁吉亚Georgia 2007、Georgia 2008 以及中国AnhuiXCGQ 等基因Ⅱ型毒株CD2v 蛋白氨基酸序列一致性高达100%，与其他基因型的氨基酸一致性在76.8%～81.7%之间。同时还可以看出，CD2v 蛋白氨基酸序列末端（C 端）出现了KPCPPP 的重复序列。

图2 ASFV CD2v 氨基酸序列分析结果Fig.2 ASFV CD2v amino acid sequence analysis results

2.2 CD2v 蛋白理化性质分析结果

根据ExPASy 在线工具中的ProtParam 分析结果显示：CD2v 蛋白共360aa，分子量为41.008 89 kD，其中天冬氨酸（12.5%）、异亮氨酸（12.5%）、脯氨酸（11.4%）和苏氨酸（9.7%）占比最高，其他氨基酸占比从0.6% ～8.9% 不等；理论等电点为6.21，带负电荷的氨基酸总数为24，带正电荷的氨基酸总数为22；原子总数为5 749，分子式为C1868H2858N460O548S15；预测280 nm 消光系数为51 800 M-1cm-1～52 550 M-1cm-1；在哺乳动物体外网织红细胞中的半衰期为30 h，在酵母体内半衰期大于20 h，在大肠杆菌体内半衰期大于10 h；不稳定指数为47.78，脂肪指数为88.81，亲水性总平均值为-0.209，说明该蛋白属于亲水性蛋白。

2.3 CD2v 蛋白结构和亚细胞定位预测

Pig/HLJ/2018 株ASFV CD2v 蛋白一级结构表明该基因全长1 080 bp，G+C 含量为27.88%，A+T含量为72.12%；表达的蛋白为41.008 89 kD，通过在线工具GOR4 预测的CD2v 蛋白二级结构结果（图3）显示，α-螺旋占5.56%，扩展链占31.11%、无规卷曲占63.33%；将CD2v 蛋白序列提交在线工具Swiss-Model 预测该蛋白的三级结构模型（见图4），证明了该蛋白主要以无规卷曲为主。

图3 CD2v 蛋白二级结构预测结果Fig.3 Rediction results of secondary structure of CD2v protein

图4 CD2v 蛋白三级结构预测结果Fig.4 Prediction of tertiary structure of CD2v protein

根据在线工具cNLS Mapper 和Psort 预测结果显示，该蛋白可能包括一段NLS 单分型序列（表2），无双分型序列，其cut-off 分数为7.5；CD2v 蛋白可能定位于高尔基体的概率为22.2%，定位于内质网和内膜的概率均为11.1%。

表2 ASFV CD2v 蛋白序列单分型NLS 预测Table 2 Single NLS prediction of ASFV CD2v protein sequence

2.4 CD2v 蛋白跨膜区和信号肽分析结果

根据TMHMM-2.0 在线工具分析结果显示，CD2v 蛋白存在一个跨膜区（见图5-A），信号肽分析结果的可能性为0.925，说明存在信号肽（见图5-B）。

图5 CD2v 蛋白跨膜区和信号肽预测结果Fig.5 Prediction results of CD2v protein transmembrane region and signal peptide

2.5 CD2v 蛋白B 细胞和T 细胞抗原表位分析结果

根据在线分析工具BepiPred 1.0、IEDB 分析序列B 细胞抗原表位区域结果显示，存在9 个B 细胞抗原表位；根据NetMHC 4.0、NetMHCpan 4.1 在线服务器分析序列T 细胞抗原表位区域结果显示，CD2v 蛋白存在14 个T 细胞抗原表位；结合2.3 中预测的二级结构，去掉其中的α-螺旋等筛选出4 个优势B 细胞抗原表位和5 个优势T 细胞抗原表位（见表3）。

表3 CD2v 蛋白优势B、T 细胞抗原表位分析统计结果Table 3 Statistical results of CD2v protein dominant B cell and T cell epitope analysis

3 讨论与结论

ASFV 是一种基因组庞大而复杂的DNA 病毒，可导致猪的急性死亡，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。我国于2018 年在辽宁首次爆发ASF［13］，之后迅速蔓延至多个省市和地区，并呈区域性流行，严重威胁着我国养猪业的健康发展。尽管政府部门按照一类传染病的防控措施，对疫区及受威胁地区进行了严格的管控［14］，但防控形势依然严峻，急需安全有效的疫苗用于本病的防控。然而，由于对ASFV 与宿主之间的作用机制、病毒在宿主体内的复制调控机制尚不清楚，对与病毒免疫逃避相关蛋白的研究相对较少，目前尚无商品化的非洲猪瘟疫苗。因此，深入研究病毒蛋白的结构和功能，将有助于病毒致病机制的阐明以及非洲猪瘟疫苗的研发。

3.1 ASFV CD2v 蛋白的遗传变异分析

CD2v 蛋白位于ASFV 的外层囊膜，可诱导机体产生中和抗体，是病毒毒力及免疫逃避的相关蛋白之一［15-16］。本研究对ASFV CD2v 蛋白氨基酸序列分析结果显示，不同基因型之间氨基酸序列存在较大差异，以中国流行株Pig/HLJ/2018 株ASFV CD2v 蛋白氨基酸序列为例，在C 末端出现了连续的重复序列（KPCPPP），研究表明，该重复序列是一种遗传标记或抗原表位［17-18］，Yang 等［18］确认了该重复序列（KPCPPP）为细胞穿透肽(CPP)，CPP 是多种多肽家族，通常由5 ～30 个氨基酸组成，可通过能量依赖或能量独立机制通过组织和细胞膜，不与特定受体相互作用［19］，它可以携带EGFP 通过网格蛋白和微胞饮介导的内吞进入CHO 细胞，这为ASFV 颗粒进入细胞的方式提供了新的见解，同时也提示ASFV研究可以发展成为药物传递的工具。另外，连续的脯氨酸序列与宿主SH3 结构域蛋白SH3P7/mAbp1 结合，并在囊泡运输中发挥作用［20］。对ASFV CD2v 蛋白遗传进化与氨基酸序列分析表明该蛋白可作为ASF 治疗药物和预防疫苗的研究靶点，为ASF 的有效防控奠定基础。

3.2 ASFV CD2v 蛋白结构和抗原表位

对ASFV CD2v 蛋白的结构分析结果显示，CD2v 是一种跨膜蛋白，蛋白二级结构显示α-螺旋结构占5.56%，存在跨膜区和信号肽，具有由2 个免疫球蛋白样结构域组成的细胞外N 端区域和胞质C 端区域，与Rodríguez 等［21］的研究结果相一致。Sereda 等［22］研究表明CD2v 蛋白能介导红细胞对ASFV 感染细胞的吸附作用，并指出ASF 保护性免疫可能是血清型特异性的表现，血液吸附(HAI)抑制同一血清型内的病毒互相交叉保护，而同一血清型外的病毒则没有交叉保护；同时Malogolovkin 等［23］根据CD2v 蛋白HAI 特性进行了血清学分型，发现同一基因型下的毒株表现出不同的血清型分型，这可能更好地解释ASFV 分离株之间的同源交叉保护问题和影响疾病出现的病毒决定因素，表明ASFV CD2v 蛋白的血清分型对疫苗的设计和开发非常重要。T 细胞介导的细胞免疫和B 细胞介导的体液免疫，在机体抵抗病原微生物感染的过程中，发挥着重要作用，B、T 细胞的优势抗原表位常用于靶向药物或表位疫苗的研制，Burmakina 等［24］在免疫动物攻毒后7 ～10 d，观察到T 细胞对病毒的强大反应，并鉴定出了在ASF 保护性免疫环境中诱导T 细胞应答的T 细胞表位区域，这表明ASFV 的T 细胞表位对保护性宿主反应具有重要意义。同时，Burmakina等［24］提示T 细胞表位对给定的病毒血清型也有特异性，T 细胞宿主反应可能与观察到的血清型特异性保护有关。本研究通过在线工具筛选出4 个优势B 细胞抗原表位和5 个优势T 细胞抗原表位，可作为靶向药物、表位疫苗筛选的对象［6］，有助于ASFV 亚单位疫苗的设计和开发。

通过对ASFV 的CD2v 蛋白及其基因进行生物信息学分析，深入解析了中国流行毒株Pig/HLJ/2018株CD2v 蛋白基因的遗传进化情况以及CD2v 蛋白的结构与功能关系，为进一步阐明病毒-宿主相互作用机制以及ASFV 疫苗的研发奠定了基础。