微小RNA-107调控内质网应激对喉癌Hep-2细胞癌增殖及凋亡的影响

杨雪，冯志星，马海滨，任雪燕，单珊，韩海平

喉癌是一种呼吸道最为常见的恶性肿瘤之一，在我国喉癌约占头颈部恶性肿瘤发病率的14%，约占全身癌症的1%～5%［1-2］。尽管随着医疗技术水平的进步，在临床上针对喉癌的治疗方式有了一定的提高，但喉癌患者预后依旧效果不佳，严重影响了患者的生活质量［3］。miR-107 作为微小核糖核酸（microRNAs，miRNA）家族一员，已被证实在多种肿瘤组织中存在异常表达，参与了包括胃癌、结直肠癌和卵巢癌等多种癌症的发生、发展过程［4-6］。内质网作为调节胞内蛋白质合成、折叠和聚积的细胞器，在病理刺激下内质网功能会受到影响，未折叠蛋白和错误折叠蛋白过度聚集于内质网，引发内质网应激反应［7］。当内质网发生应激反应时，蛋白激酶R 样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）作为感受内质网应激信号的跨膜蛋白被激活，活化转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）持续过表达，提高分子伴侣水平，使得细胞适应内质网应激，维持胞内稳态［8-9］。本研究自2020年2—7 月检测miR-107 在喉癌Hep-2 细胞中的表达，探讨miR-107 调控内质网应激对细胞增殖和凋亡影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料实验细胞：Hep-2 喉癌细胞株由中国科学院（上海）细胞库提供。

实验试剂及材料：RPMI1640 培养基、胎牛血清由美国Hylcon 公司提供，MTT、Trizol 试剂、SYBR@Green RT—PCR 试剂盒、RNA 逆转录试剂盒均购自Sigma-Aldrich 公司，miR-107 寡聚核苷酸、PCR 引物合成均由上海生工生物有限公司完成，兔抗人凋亡抑制蛋白单克隆抗体购自美国Abcam 公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体、山羊抗兔IgG二抗均购自美Bioword公司。

1.2 试验方法

1.2.1 Hep-2 细胞培养及转染将Hep-2 细胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素的RPMI1640 培养基中培养，在37 ℃、5% 二氧化碳培养箱中孵育，每2 天进行一次传代。参考Lipofectamine2000 转染说明书进行操作，空白组不做任何干预，将miR-107类似物（miR-107 mimics）和阴性对照（negative control）片段转染至mimics组和NG组细胞中，其中转染浓度为60 nmol/L。转染后在37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中孵育，收集生长状况良好，处于对数生长期时的细胞进行后续的实验操作。

1.2.2 RT-PCR 检测各组Hep-2 细胞中miR-107 相对表达量取处于转染48 h的Hep-2喉癌细胞通过Trizol 试剂提取得到转染细胞中的总RNA，参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，应用SYBRGreen 实时荧光定量PCR 法，对miR-107 的表达进行荧光定量分析。热循环反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s 共40个循环。选择U6 作为miR-107 的内参，所得数据用2-ΔΔCt值法计算各组细胞中miR-107的相对表达量。

1.2.3 蛋白质印迹法（Western blotting）检测各组Hep-2 细胞中PERK 及ATF4 蛋白的表达取处转染48 h 的Hep-2 喉癌细胞，加入裂解液以提取各种细胞总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。每孔加入50µg 蛋白溶液进行电泳分离后转膜，5%脱脂奶粉封闭，4 ℃冰箱孵育过夜，用兔抗人单克隆一抗（工作浓度1∶5 000）室温下孵育2 h，再用过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（工作浓度1∶5 000）室温下孵育30 min，以GAPDH 为内参，用Bandscan 5.0软件进行半定量分析。

1.2.4 四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定Hep-2细胞的增殖能力取对数生长期的Hep-2 细胞以2 000 个/孔接种于96 孔板，每组6 个复孔，转染12、24、36 h后每孔加入5 g/L MTT 20µL，37 ℃孵育4 h，弃去培养基，每孔加二甲基亚砜150 µL 低速振荡10 min，置酶标仪于570 nm 测定各孔的吸光度。吸光度值越高则意味着细胞越多。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡用转染48 h 后的各组细胞，经预冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗后，重悬收集细胞，并用PBS 洗涤3 次。加入Annexin V-FITC 混匀，在室温条件下避光染色20 min，再加入PI，在一小时内使用流式细胞仪观察各组细胞的凋亡情况。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料采用±s表示，方差齐的多组均值比较采用用单因素方差分析，多组间两两比较行LSD 法，方差不齐的多组均值采用秩和检验分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hep-2细胞中miR-107相对表达量转染48 h后，RT-PCR 检测结果显示，三组转染细胞miR-107相对表达量差异有统计学意义（χ2=11.50，P=0.003）。与mimics 组（15.32±1.94）比较，NG 组（0.97±0.02）、空白组miR-107 相对表达量（0.96±0.03）均降低（P＜0.05）。

2.2 Hep-2 细胞中PERK 和ATF4 蛋白的相对表达量三组转染细胞的PERK 和ATF4 蛋白表达水平均差异有统计学意义（P＜0.05）。与mimics 组相比较，NG 组和空白组的PERK 和ATF4 蛋白相对表达量均降低（P＜0.05）。结果见图1、表1。

图1 三组转染细胞中PERK和ATF4蛋白的表达

表1 三组转染细胞中蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）及活化转录因子4（ATF4）蛋白相对表达量的比较/±s

表1 三组转染细胞中蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）及活化转录因子4（ATF4）蛋白相对表达量的比较/±s

注：①与mimics组相比较，P＜0.05。

组别mimics组NG组空白组F值P值重复次数666 PERK 0.53±0.07 0.18±0.05①0.19±0.05①70.35＜0.001 ATF4 0.75±0.06 0.28±0.04①0.29±0.04①183.77＜0.001

2.3 miR-107 对Hep-2 细胞的增殖能力的影响MTT 分析结果显示，mimics 组、NG 组和空白组细胞的增殖能力差异有统计学意义（P＜0.05）。与mimics 组比较，在12、24、36 h 后NG 组、空白组Hep-2 细胞增殖能力均有显著升高（P＜0.05）。结果见表2。

表2 三组转染细胞在570 nm光密度（OD）值比较/±s

表2 三组转染细胞在570 nm光密度（OD）值比较/±s

组别mimics组NG组空白组F值P值重复次数6 66 miR-107 12 h 0.12±0.02 0.18±0.02 0.19±0.02 21.44＜0.001 24 h 0.24±0.04 0.39±0.04 0.41±0.05 28.38＜0.001 36 h 0.37±0.04 0.61±0.05 0.63±0.05 59.14＜0.001

2.4 miR-107对Hep-2细胞凋亡的影响三组转染细胞的细胞凋亡率比较差异有统计学意义（F=102.32，P＜0.05）。与mimics 组（10.18±0.93）%比较，NG 组（4.33±0.68）%和空白组细胞凋亡率（4.55±0.78）%均降低（P＜0.05），NG 组细胞凋亡率与空白组差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

喉癌作为头颈部较为常见的恶性肿瘤之一，并且发病率在近年来有上升趋势。有研究［10］认为，喉癌的发生可能与吸烟、饮酒及空气污染等因素有关，且存在多种因素相互作用，但目前对其具体发病机制尚未明确，临床上喉癌的预后效果不佳。因此，喉癌发病机制及喉癌治疗靶点的研究对于喉癌的临床诊治具有重要意义。

近年来有研究表明，miRNA 能够通过多种机制对癌症的发生、发展起到调控作用［11］。研究发现，在肺癌组织中miR-107 表达明显降低，过表达的miR-107 通过Notch 信号通过能够显著抑制肺癌细胞A549 的增殖、侵袭和迁移能力［12］，贾振亚等［13］研究也发现，上调miR-107的表达能够明显抑制Hep-2细胞的增殖。在本次研究中，取喉癌Hep-2 细胞分别转染miR-107mimics、negative control 片段，目的在于促进Hep-2 细胞中miR-107 表达，实验结果显示，与mimics 组相比较，NG 组、空白组miR-107 相对表达量均降低，结果提示转染成功，可以利用此细胞用于后续实验的探讨。MTT 结果显示，成功上调miR-107 表达的mimics 组Hep-2 细胞在12、24、36 h后的增殖能力均低于NG 组、空白组，并且随时间的增加差异愈加明显；另一方面，与mimics 组相比较，NG 组和空白组的细胞凋亡率均降低。这一结果提示miR-107 与喉癌Hep-2 细胞的增殖和凋亡密切相关，当miR-107 过表达时，能够抑制喉癌Hep-2 细胞的增殖，并促进其凋亡。

内质网应激是细胞在缺氧、氧化应激等各种因素刺激下，引发内质网内为折叠蛋白及错位折叠蛋白聚集，内质网调节能力失控进而导致其功能紊乱的状态［14］。当内质网应激信号存在时，作为内质网膜上跨膜蛋白的PERK 被激活，发生二聚化和磷酸化，同时大多数mRNA 的翻译受到抑制，蛋白质的合成减少；而ATF4 mRNA表达得到促进，ATF4过表达能够促进Bcl-2 家族蛋白失衡，引发与细胞凋亡、氧化还原反应等有关基因的转录翻译［8，15］。有研究表明，上调ATF4 的表达能够诱导肝癌细胞凋亡［16］。本次研究发现，与mimics 组相比较，NG 组和空白组的PERK 和ATF4蛋白相对表达量均降低，这一结果提示了PERK和ATF4参与了喉癌的发展过程。

综上所述，miR-107的表达与喉癌Hep-2细胞增殖及凋亡有关，上调miR-21 能够抑制喉癌Hep-2 细胞增殖、促进喉癌Hep-2细胞凋亡，其作用机制可能与内质网应激有关，在一定程度上为喉癌临床治疗提供了理论参考。此外，本研究也存在一定的不足之处，如只采用了喉癌Hep-2细胞实验，后续还可通过动物实验对数据进行补充，进一步探讨miR-107对喉癌的具体作用及其机制。