长链非编码RNA HULC在乳腺癌组织中表达及临床意义

袁小笋，张蕾，马慧利，薛永飞，李长生，张敬伟，任中海，张腾飞

乳腺癌作为女性高发恶性肿瘤，尽管病人早期发现率不断提高，且诊疗手段的不断进步，但病人远期预后仍然改善有限［1］，转移和复发仍是导致病人死亡的主要因素［2］。因此，深入探讨与乳腺癌转移相关的机制或敏感基因对指导病人临床诊疗及改善预后意义重大。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一种长度在200 nt以上且缺乏编译蛋白功能的RNA，以往被认为是一种“垃圾基因”，随着研究深入，其在表观遗传修饰及基因转录和翻译中的调控作用越来越受到重视［3］，已被发现参与了多种疾病发生过程［4］，同时与肿瘤生长、侵袭转移等密切相关［5］，肝癌高表达转录本（highly upregulated in liver cancer，HULC）是最早在肝癌中发现的一种lncRNA［6］，近年来发现其在胰腺癌［7］、淋巴瘤［8］等多种恶性肿瘤组织中表达异常，但其在乳腺癌组织表达如何鲜有报道。本研究分析乳腺癌组织中HULC 表达，探讨其在不同临床病理指标间表达差异性，以及与预后的相关性，以期为乳腺癌机制研究及临床诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2013 年5 月至2015 年5 月在南阳市中心医院乳腺科行手术治疗且资料完整的乳腺癌病人112例，入选病人均为女性，术前未接受放化疗，术后病理学检查证实。年龄（56.58±11.52）岁，范围为26～75 岁。病理学类型：浸润性导管癌88 例，其他类型24 例；肿瘤直径：＞2 cm 62 例，≤2 cm 50 例；组织学分级：Ⅰ级31 例，Ⅱ级46 例，Ⅲ级35例；按照第七版TNM 分期标准：Ⅰ期24 例，Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期36 例；发生腋窝淋巴结转移41 例，根

据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人类表皮生长因子受体2（HER-2）和Ki-67 检查结果进行分子分型：Luminal A 型33 例，Luminal B 型29 例，HER-2过表达型21 例，三阴性（TNBC）型29 例。所有病人于手术中留取乳腺癌及距离肿瘤边缘＞5 cm 正常乳腺组织，快速置于液氮中，-80 ℃保存。病人或其近亲属均行知情同意。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR 术检测乳腺癌和正常乳腺组织中HULC 表达取组织，剪碎、研磨，加入细胞裂解液，按总RNA 提取试剂盒（Trizol 法，购自上海百研生物科技有限公司）说明提取总RNA，并利用逆转录试剂盒（购自美国Thermo 公司）获得cDNA，使用美国ABI 公司生产的7500 荧光定量PCR仪按SYBR green RT-PCR 反应试剂盒（购自美国Thermo 公司）扩增引物。引物序列：HULC：正向引物为5’-ACTCTGAAGTAAAGGCCGGA-3’，反向引物为5’-TGCCAGGAAACTTCTTGCTTG-3’，GAPDH：正向引物为5’-CCCTTCATTGACCTCAACTA-3’，反向引物为5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。反应条件：95 ℃2 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，连续38 次循环。用2-ΔΔCt法计算HULC 表达量。

1.2.2 病例随访 112 例病人均于术后1 天开始随访，中途无失访，随访形式包括住院期间查房、出院后门诊复查、病历追踪等，随访截止日期2020 年5月31 日，所有病人随访满5 年，以死亡作为终点事件，记录病人生存时间。

1.3 统计学方法使用SPSS 21.0 软件分析，计量资料采用±s表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析，采用Kaplan-Meier 法进行生存分析，采用Cox 比例风险回归模型分析影响乳腺癌病人预后的风险因素。

2 结果

2.1 乳腺癌和正常乳腺组织中HULC 表达乳腺癌组织中HULC 表达量为（2.27±0.18），高于正常乳腺组织的（1.02±0.08），差异有统计意义（t=67.38，P＜0.001）。

2.2 不同临床病理指标的乳腺癌组织中HULC 表达不同年龄、病理学类型、肿瘤直径、是否绝经、分子分型、PR 和HER-2 的乳腺癌组织中HULC 表达量差异无统计学意义（P＞0.05），不同组织学分级、TNM 分期、淋巴结转移、ER 和Ki-67 的乳腺癌组织中HULC 表达量差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同临床病理指标的乳腺癌组织中HULC表达/±s

表1 不同临床病理指标的乳腺癌组织中HULC表达/±s

注：ER为雌激素受体，PR为孕激素受体，HER-2为人类表皮生长因子受体2。

指标年龄≥57岁＜57岁病理学类型浸润性导管癌其他类型肿瘤长径＞2 cm≤2 cm绝经是否组织学分级Ⅰ～Ⅱ级Ⅲ级TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴结转移是否分子分型Luminal A型Luminal B型HER-2过表达型TNBC型ER阳性阴性PR阳性阴性HER-2阳性阴性Ki-67≥20%＜20%例数66 46 88 24 62 50 67 45 77 35 76 36 41 71 33 29 21 29 67 45 43 69 65 47 67 45 HULC表达量2.26±0.18 2.29±0.19 2.29±0.18 2.23±0.16 2.28±0.17 2.26±0.19 2.25±0.17 2.30±0.19 2.24±0.17 2.34±0.18 2.23±0.16 2.36±0.19 2.36±0.18 2.22±0.16 2.27±0.17 2.26±0.18 2.22±0.15 2.32±0.21 2.31±0.16 2.22±0.20 2.31±0.17 2.25±0.18 2.29±0.17 2.25±0.19 2.24±0.17 2.32±0.18 t值0.73 1.50 0.51 1.45 2.70 3.51 4.16 1.13 2.56 1.55 1.38 2.44 P值0.466 0.135 0.609 0.149 0.008 0.001＜0.001 0.342 0.012 0.124 0.169 0.016

2.3 乳腺癌组织中HULC 表达对生存时间的影响 112例病人随访时间2～60个月，中位随访时间44 个月。以乳腺癌组织中HULC 表达量的P25值为界值［9］，将病人分为低表达组（n=29）和高表达组（n=83），生存分析结果显示，低表达组病人平均生存时间（52.72±3.06）个月，5 年生存率为82.76%，高表达组病人则分别为（35.51±2.25）个月和36.14%，Log-Rank检验差异有统计学意义（χ2=15.16，P＜0.001）。

2.4 乳腺癌病人预后影响因素分析 Cox比例风险回归模型分析结果显示，HULC 表达是影响乳腺癌病人预后的独立风险因素［HR=5.249（95%CI：1.965～14.024），P＜0.05］，见表2。

表2 乳腺癌病人预后影响因素的Cox比例风险回归模型分析

3 讨论

乳腺癌作为威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一，发病率呈逐年升高趋势且发病年龄年轻化［10］，虽然现有的综合性及个体化治疗手段不断进步，但乳腺癌细胞易转移，特别是发生脑、肺、骨等远处转移仍是导致病人治疗失败及死亡的主要影响因素［11］。但目前，有关乳腺癌转移的相关机制及作用基因尚未完全研究清楚。有研究指出，lncRNA 表达失调参与了恶性肿瘤侵袭转移过程［12］。且乳腺癌病人存在lncRNA 表达异常［13-14］。HULC 作为一种位于人染色体6p24.3 上的lncRNA，主要位于细胞质，可通过结合核糖体而在多种生理病理过程中发挥重要作用［15］。有研究指出［16］，HULC 在HBV 相关肝癌表达量升高，可作为早期诊断潜在标志。叶华等［17］指出，HULC 参与了胆管细胞癌的发生和发展。王鹏等［18］则指出，HULC 调控肺腺癌细胞的增殖和侵袭。本研究结果显示，乳腺癌组织中HULC 表达量高于正常乳腺组织，说明HULC 在乳腺癌组织中呈高表达。且进一步分析发现，组织学分级Ⅲ级、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、发生淋巴结转移的乳腺癌组织中HULC 表达量升高，说明HULC 表达与乳腺癌恶性进程指标有关，可能参与了乳腺癌恶性进行，同时，本研究显示，ER 阳性和Ki-67＜20%的腺癌组织中HULC 表达量升高，进一步说明HULC 可能通过调控ER 活化剂参与细胞增殖而在乳腺癌进程中发挥作用，但具体作用机制有待开展相关研究予以明确。

Ding等［19］通过对各种癌症病人HULC 的预后价值进行荟萃分析和系统评价发现，lncRNA HULC 可作为癌症预后和转移的新分子标记。本研究Kaplan-Meier 分析结果显示，HULC 低表达组病人平均生存时间和5 年生存率均高于高表达组，说明乳腺癌病人组织中HULC 高表达可能与其不良预后有关。行Cox比例风险回归模型分析发现，HULC表达是影响乳腺癌病人预后的风险因素，进一步说明HULC 表达可能是影响病人预后的因素，可能是评估病人预后的潜在标志物。

综上所述，乳腺癌组织中HULC 表达量升高，可能发挥类似癌基因的作用而参与了乳腺癌进展，且是影响病人预后的风险因素，有望成为评估病人预后的潜在标志物。