七氟醚通过mTOR信号通路诱导人神经母细胞瘤细胞自噬的发生

吕静静，程 浩，刘 虎，金孝岠，陈永权

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 麻醉科，安徽 芜湖 241001)

七氟醚由于其诱导及苏醒迅速、具有芳香气味、对血流动力学影响较小等优点，已成为目前临床上最常使用的吸入麻醉药之一，大量体外及在体实验研究表明其对发育中的大脑具有神经毒性[1-2]，并引起长期的学习记忆及神经行为学异常[3]。发育大脑的神经细胞凋亡与七氟醚神经毒性密切相关[4]。自噬是真核生物中进化上高度保守的细胞途径，参与神经细胞的存活、分化和死亡，并与多种神经退行性疾病相关[5]。适当水平的自噬可以阻止细胞凋亡的发生[6]。有研究表明七氟醚激活神经细胞自噬[7]，增加自噬可显著抑制七氟醚诱导的神经毒性[8]，但七氟醚激活自噬的具体机制并不十分明确。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是参与自噬调控的主要负调控因子[9]，本研究拟探讨七氟醚暴露对SHSY-5Y细胞自噬的影响及mTOR信号通路是否在其中发挥关键作用，从而为七氟醚发育神经毒性提供可能的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 人神经母细胞瘤细胞(SHSY-5Y细胞)(上海中科院细胞库)，雷帕霉素、lipofectamine2000、青霉素、链霉素、DMSO、β-actin一抗(Sigma公司，美国)，LC3B、Atg5、p-mTOR、t-mTOR一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗(Cell Signaling公司，美国)，胎牛血清、高糖DMEM培养基(Gibco公司，美国)，HERAcell 150i CO2培养箱(Thermo公司，美国)，共聚焦显微镜(Zeiss公司，德国)，FluorChem E化学发光高灵敏度凝胶成像与分析仪(Protein Simple公司，美国)。

1.2 SHSY-5Y细胞培养 使用高糖DMEM培养基，加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素，进行SHSY-5Y细胞的培养，将铺板的细胞置于95%空气、5%CO2湿化的37℃培养箱内，每48 h更换1次培养液，待细胞增长至80%～90%汇合时进行传代或铺板，用于实验的细胞于24 h后进行药物处理。

1.3 实验分组及药物处理 取传3或4代的细胞随机分为4组(n=12)，空白对照组(C组)、空白对照+雷帕霉素50 nmol/L组(C+R组)、4.8%七氟醚12 h组(S组)和4.8%七氟醚12 h+雷帕霉素50 nmol/L组(S+R组)。于细胞铺板24 h后，C+R组及S+R组加入雷帕霉素50 nmol/L，C组及S组加入等体积的溶剂DMSO，共培养1 h后将S组及S+R组置入37℃培养箱内含4.8%七氟醚的密闭箱中处理12 h，C组及C+R组置入密闭箱外同一培养箱中继续培养12 h，收集细胞进行Western blot实验。细胞铺板24 h后，使用mRFP-EGFP-LC3质粒转染C组、C+R组、S组、S+R组12 h，12 h后C+R组及S+R组加入雷帕霉素50 nmol/L，C组及S组加入等体积的溶剂DMSO，共培养1 h后将S组及S+R组使用4.8%七氟醚处理12 h，C组及C+R组继续培养12 h，DAPI染核后共聚焦显微镜观察各组细胞荧光点数。

1.4 自噬及mTOR途径相关蛋白的测定 采用Western blot法测定自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Atg5以及p-mTOR、t-mTOR、β-actin的表达水平。于七氟醚处理结束后，各组吸去上清，使用预冷的PBS清洗两次，加入裂解缓冲液RIPA 200 μl提取总蛋白，采用BCA检测法测定蛋白含量。配平后取40 μg蛋白样品上样，进行电泳、转膜、5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗LC3B(1︰1 000)、Atg5(1︰1 000)、p-mTOR(1︰1 000)、t-mTOR(1︰1 000)和β-actin(1︰2 000)，4℃孵育过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1︰3 000)，室温孵育2 h，TBST洗膜后ECL显色，采用化学发光高灵敏度凝胶成像与分析仪进行曝光，并采用Image J图像分析系统进行分析，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值反应目的蛋白的表达水平，所有实验独立重复3次。

1.5 细胞自噬检测(mRFP-EGFP-LC3质粒转染) 细胞转染及药物处理如1.2和1.3所述，处理结束后用冰PBS清洗两次，加入5 μg/mL DAPI室温孵育10 min染核，4%多聚甲醛固定，使用共聚焦显微镜进行观察，每组随机选取40个细胞拍照，由非实验操作人员肉眼观察并计数各组40个细胞合成图片中mRFP-EGFP-LC3点的数量(绿色荧光、红色荧光融合成黄色荧光点GFP+RFP+表示自噬小体，单独的红色荧光点GFP-RFP+表示自噬溶酶体)，实验独立重复3次明确七氟醚对自噬流的影响及雷帕霉素在其中的作用。

2 结果

2.1 各组自噬相关蛋白LC3和Atg5的表达比较 Western blot结果显示，与C组比较，C+R组、S组和S+R组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Atg5表达均增高(P<0.05)；与C+R组和S组比较，S+R组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Atg5表达也增高(P<0.01)(见图1A、B、C)。

A.各组自噬相关蛋白条带图；B.F=54.73,P=0.000;C.F=37.82,P=0.000;D.F=168.9,P=0.000。*P<0.05，***P<0.001 vs. C组；##P<0.01，###P<0.001 vs. C+R组；$$P<0.01，$$$P<0.001 vs. S组。

2.2 各组mTOR信号通路相关蛋白表达比较 Western blot结果显示，与C组比较，C+R组、S组和S+R组p-mTOR/t-mTOR比值均降低(P<0.001)；与C+R组和S组比较，S+R组p-mTOR/t-mTOR比值也降低(P<0.001)(见图1A、D)。

2.3 各组自噬小体和自噬溶酶体数量比较 mRFP-EGFP-LC3质粒转染结果显示，与C组比较，C+R组、S组和S+R组自噬小体、自噬溶酶体数量均增加(P<0.001)；与C+R组和S组比较，S+R组自噬小体、自噬溶酶体数量也增加(P<0.001)(见图2)。

A.各组mRFP-EGFP-LC3质粒转染荧光图；B.F=214.2,P=0.000;C.F=136.7,P=0.000。***P<0.001 vs. C组；###P<0.001 vs. C+R组；$$$P<0.001 vs. S组。

3 讨论

大量前期临床研究表明七氟醚诱导发育神经毒性[1-4]，减少神经细胞数量。Piao等[10]研究发现七氟醚通过增加细胞内活性氧来诱导发育大脑的神经毒性，使用活性氧的抑制剂NAC可以显著减轻七氟醚的神经细胞损伤。自噬是一种进化保守的细胞内自我吞噬的过程，主要去除受损的细胞器、聚集的蛋白质以及细胞内病原体等[11]。Fan等[12]研究表明自噬降低SHSY-5Y细胞中活性氧的水平，抑制C2-神经酰胺介导的细胞死亡。Xu等[7]发现7日龄大鼠暴露于七氟醚可激活海马神经元的自噬，增加beclin1和LC3-Ⅱ的蛋白水平；同时七氟醚增加海马神经元的凋亡，自噬可能在七氟醚发育神经元毒性中发挥重要的作用[13]。在H4人神经胶质瘤细胞模型中，Zhou等[14]研究显示七氟醚诱导ERS并激活自噬，进一步激活自噬可抑制ERS，减轻七氟醚介导的神经细胞凋亡。因此，自噬可能成为七氟醚发育神经毒性的有效预防和治疗手段，进一步探讨七氟醚激活自噬的具体机制有助于改善其发育神经毒性。

在本实验研究中，根据预实验及前期研究基础选用4.8%七氟醚(等效于临床使用中的2 MAC)作用12 h，结果表明七氟醚激活SHSY-5Y细胞自噬，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Atg5蛋白表达水平，同时mRFP-EGFP-LC3质粒转染SHSY-5Y细胞，证实七氟醚诱导自噬小体及自噬溶酶体数量均显著增加，即自噬流增加。该结果与既往研究一致，七氟醚增加自噬，本实验使用mRFP-EGFP-LC3质粒转染，更清晰地显示了自噬流的变化。

mTOR信号通路是参与自噬调控的主要负调控因子，与神经退行性疾病密切相关，抑制mTOR信号通路可诱导细胞自噬[15]。PI3K/AKT/mTOR通路是抑制细胞自噬的经典信号转导通路，Zhang等[16]研究表明七氟醚后处理可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号传导保护大鼠心脏免受缺血再灌注损伤。Xu等[17]研究显示在小鼠原代神经元的发育过程中，吸入麻醉药异氟醚通过激活mTOR途径破坏突触形成。然而，目前关于mTOR信号通路在七氟醚发育神经毒性中的作用并未研究。本研究结果表明在SHSY-5Y细胞中，七氟醚抑制mTOR途径，降低p-mTOR/t-mTOR，激活自噬；使用雷帕霉素可进一步抑制mTOR途径，增加自噬流。后续的研究需进一步证明mTOR依赖性自噬在七氟醚发育神经毒性中的作用，通过对mTOR信号通路的上下游信号分子进一步研究并使用基因敲除方法证实其关键性作用。

综上所述，本研究证明吸入麻醉药七氟醚通过mTOR信号通路诱导SHSY-5Y细胞自噬的发生。