贻贝黏附蛋白型聚氨酯黏合材料的制备*

成 昭，张翊娟，程诗雅

(1.西安医学院 药学院,陕西 西安 710021；2.西安医学院 护理学院,陕西 西安 710021)

人工合成材料的化学修饰与功能复合，是材料研发与应用领域的难点。人工材料的合成线路设计与合成条件优化可从两方面进行[1-2]：一方面调控材料结构、简化合成步骤，增强人工合成材料结构的可修饰性；另一方面进行材料的功能性复合，同时，降低人工合成材料的细胞毒性及可能免疫应激反应，保证其生物亲合性能，这对于新型功能材料的研发工作意义重大。此外，相较于天然来源材料的复杂性与分离提纯难度[3]，人工合成材料来源单纯，其结构与相对分子质量均处于一定的可调控范围，便于设计精准实验方案、系统考察合成材料的稳定性与毒性，建立仿生黏合材料在生命体环境中的安全性和适用性的系统评价参数。

作为一种生物黏合剂[4]，贻贝黏附蛋白(MAP)结构中的黏合单元邻二酚[5]，能够通过在水环境中的离解与带电[6]、氧化与交联[7]等作用过程，实现贻贝在岩石、钢铁、玻璃等多种材料界面的稳定黏合[8-9]。设计在人工合成黏合剂中引入高化学活性的邻二酚黏合单元[10]，能够降低合成材料的细胞毒性及可能免疫应激反应，改善人工黏合剂的黏附与生物相容性能。另外，借助于聚氨酯材料的化学修饰活性[11]，通过聚氨酯材料的扩链与功能片段接入等过程，能够有效简化合成步骤。本文设计以扩链、偶联两步主要反应，合成得到一种MAP型聚氨酯黏合材料，并进行路线优化、热稳定性与细胞毒性考察，初步评价了该聚氨酯黏合材料应用于生命体环境的安全性和适用性[12]。此外，合成路线的分段调控加强了黏合材料合成的可修饰性，为人工黏合材料未来研发工作中的分节点合成与功能化修饰提供了参考。

1 实验部分

1.1 原料

二丁基二月桂酸锡(DBTL)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；聚丙二醇400(PPG 400)、异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)、二羟甲基丙酸(DMPA)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、多巴胺盐酸盐、N,N′-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺、二甲基亚砜(DMSO)：分析纯，阿拉丁试剂有限公司。上述市售试剂均经过除水等预处理，具体方法为：PPG 400、DMPA于100 ℃下减压干燥3 h；DMF以干燥剂无水硫酸钠进行初步无水处理，再经90 ℃减压蒸馏，加入4Å分子筛(孔径为0.4 nm)，待用；三乙胺以干燥剂无水硫酸钠进行初步无水处理，再经常压蒸馏，加入4Å分子筛(孔径为0.4 nm)，待用。

1.2 仪器及设备

傅里叶变换红外分光光度计：TENSOR T-27，德国BRUKER公司；超导核磁共振波谱仪：AVANCE Ⅲ 400 MHz，德国BRUKER公司；凝胶渗透色谱仪：PL-GPC50，美国Agilent Technologie公司；热失重分析仪：PE-TGA7，美国Perkin Elmer公司；多功能酶联免疫检测仪：1510 Mwltiskan Go，美国Thermo Fisher公司。

1.3 合成制备

为了加强合成材料的化学修饰性，目标MAP型聚氨酯黏合材料以扩链与偶联为主要合成步骤进行分段调控法合成，引入邻二酚黏合单元。首先，初步保证该合成材料的低毒性及生物相容性；其次，使人工黏合材料未来研发工作中的分节点合成与功能化修饰进一步成为可能。

目标聚氨酯黏合材料设计扩链、偶联两步合成路径(见图1)：1)以IPDI与PPG 400为初始原料，得到聚氨酯预聚物(化合物1)，再经扩链剂DMPA、缩合剂DCC与催化剂DBTL共同作用于扩链步骤，得到聚氨酯预聚物扩链产物(化合物2)；2)为了进一步改善目标材料的聚合性能及相对分子质量分布，在平均相对分子质量较小的扩链产物结构基础上，通过功能修饰调控与邻二酚黏合单元接入，合成得到目标MAP型聚氨酯黏合材料(化合物3)。

图1 MAP型聚氨酯黏合材料的合成路径

(1)化合物1：聚氨酯预聚物的合成

将IPDI、PPG 400(物质的量比为2∶1.2)与适量溶剂DMF混合均匀，氮气保护反应6 h，经减压蒸馏，得到无色至浅黄色油状物的聚氨酯预聚物，即PPG400-IPDI(化合物1)。

(2)化合物2：聚氨酯预聚物扩链产物的合成

作为高分子材料扩链与枝节化的关键步骤，扩链剂DMPA与催化剂DBTL的反应投入量对聚氨酯预聚物扩链合成步骤具有重要意义。为了筛选最优条件，调控化合物1、DMPA与DBTL物质的量比分别为1∶1∶0.2、1∶2∶0.2、1∶2∶0，合成得到三种不同投料比的预聚物扩链产物P1、P2、P3。经后续的偶联反应得到三种终产物，即分别以P1、P2、P3衍生修饰的黏合材料。进行三种黏合材料的红外光谱与核磁共振氢谱测定，结合光谱结果，分析以P1、P2、P3衍生修饰的三种黏合材料的枝节率水平与扩链程度，考察DMPA与DBTL两种关键反应物对预聚物扩链反应的影响，进而确定最优反应投料比为化合物1、DMPA与DBTL物质的量比为1∶2∶0.2。

根据上述反应物投料比筛选的最优条件，将步骤(1)得到的化合物1、DMPA、DBTL(物质的量比为1∶2∶0.2)与适量溶剂DMF混合均匀，氮气保护反应3 h，得到无色至浅黄色油状物的聚氨酯预聚物扩链产物，即化合物2。

(3)化合物3：MAP型聚氨酯黏合材料的合成

将步骤(2)得到的化合物2、DCC、多巴胺盐酸盐、三乙胺(物质的量比为1∶0.12∶1∶0.1)与适量溶剂DMF混合均匀，氮气保护反应8 h，得到粗产物沉淀，进行粗产物沉淀酸洗、透析，得到浅黄色油状物的MAP型聚氨酯黏合材料，即化合物3。

2 结果与讨论

2.1 MAP型聚氨酯黏合材料的结构表征

2.1.1 红外光谱对材料枝节率水平的反映

将以P1、P2衍生修饰的两种黏合材料分别进行KBr压片与红外光谱测定，得到其红外吸收光谱，如图2所示。其中，3 475 cm-1处酚羟基与1 645 cm-1处酰胺键的特征吸收峰说明聚氨酯材料侧链已成功接入了邻二酚黏合单元。

波数/cm-1

同时，红外光谱出峰强度也具有定量意义，能在一定程度上反映黏合材料聚氨酯侧链中黏合单元多巴胺的引入量以及材料枝节率水平。P1与P2分别由化合物1、DMPA、DBTL物质的量比1∶1∶0.2与1∶2∶0.2得到，再经偶联修饰后，得到以P1、P2衍生修饰的两种黏合材料，对比两种黏合材料红外光谱特征峰的出峰强度，可知扩链剂DMPA的用量加倍时，材料枝节率水平得到明显提高。

2.1.2 核磁共振氢谱对催化剂影响扩链反应的判断

合成聚氨酯预聚物扩链产物(化合物2)的扩链步骤中，为了确定催化剂DBTL对目标聚氨酯黏合材料扩链程度的影响，设计催化剂加入与未加入两条合成路径，分别得到P2与P3两种聚氨酯预聚物扩链产物，经由后续偶联反应，得到以P2、P3衍生修饰的两种黏合材料，将其分别标注为(PPG 400-IPDI)-DMPA+DBTL(P2)、PPG 400-IPDI)-DMPA(P3)。测定上述两种黏合材料1H NMR(DMSO-d6，TMS)，得到如图3所示的核磁共振氢谱，特征氢的化学位移(δ)见图3中的归属及标注。

图3中，δ=7.82与3.60分别对应于羧基与酚羟基中活泼氢的特征位移，说明聚氨酯预聚物扩链产物与多巴胺盐酸盐的反应已在聚氨酯材料侧链成功接入邻二酚黏合单元。此外，对比图3(a)与(b)两个系列的谱线，即以P2及P3衍生修饰的两种黏合材料，在保持两组谱线1H NMR测样量一致时，扩链反应中加入催化剂DBTL、再经后续偶联反应，得到的(PPG 400-IPDI)-DMPA+DBTL(P2)，其特征氢的谱线强度均有显著增强。经1H NMR测试，证明催化剂DBTL能显著提高目标MAP型聚氨酯黏合材料的枝节率，从而进一步影响材料性能。

δ(a) (PPG 400-IPDI)-DMPA+DBTL(P2)

综合红外与核磁谱图分析结果可以看出，相较于P1、P3，以最优反应投料比得到的聚氨酯预聚物扩链产物P2为基础合成的MAP型聚氨酯黏合材料，表现较高枝节率与扩链程度，因此对该黏合材料进行进一步的相对分子质量分布测定、热稳定性与安全性分析。

2.1.3 凝胶渗透色谱对材料相对分子质量分布的反映

以DMF为流动相，聚苯乙烯为标准聚合物(温度为40 ℃，流速为1.0 mL/min)，合成得到的MAP型聚氨酯黏合材料经凝胶渗透色谱(GPC)测定，得到聚合材料的相对分子质量分布，如图4和表1所示。

相对分子质量

表1 MAP型聚氨酯黏合材料的相对分子质量及其分布1)

1)Mw/Mn为多分散指数；Mp为峰位相对分子质量；Mn为数均相对分子质量；Mw为重均相对分子质量；Mz为z均相对分子质量；Mz+1为z+1均相对分子质量；Mv为黏均相对分子质量。

由表1中的Mw/Mn=1.021 32可知，多分散指数接近于1，表明所合成的高分子聚氨酯黏合材料聚合分布均匀，其Mv为955。

2.2 MAP型聚氨酯黏合材料的热稳定性与安全性评价

2.2.1 热稳定性

40～800 ℃温度范围内，进行所合成MAP型聚氨酯黏合材料的热失重分析(氮气环境，升温速率为20 ℃/min，样品用量为5 mg)，得到其热重分析曲线，如图5所示。

t/℃

由图5可知，合成的聚氨酯黏合材料表现良好的热稳定性，热失重趋势平滑、曲线连续，与弹性体的热稳定性具有相似之处[13-14]。聚氨酯合成材料具有两个热失重阶段，分别为150～250 ℃软段热失重与250～320 ℃硬段热失重，其中，软段失重因IPDI和DMPA分解而产生，硬段失重因PPG 400分解而产生。

2.2.2 细胞毒性

以四氮唑蓝比色法(MTT)评价所合成MAP型聚氨酯黏合材料的细胞毒性，得到聚氨酯合成材料对体外活细胞的增殖抑制作用曲线，如图6所示。在温度为37 ℃、CO2含量为5%(体积分数)、湿度为90%的条件下，将所合成聚氨酯黏合材料的DMF溶液加入培养24 h的人脐静脉内皮细胞(EVC304)中，进行目标材料的质量浓度梯度分组，使各组聚氨酯黏合材料的最终质量浓度分别为125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/L，每组质量浓度设6个平行孔，对照组加入等体积溶剂。加样后，于上述条件下继续培养24 h，每孔加入20 μL四氮唑蓝溶液和180 μL培养液，培养4 h。移去上清液，每孔再加入DMSO150 μL，充分震荡后测定490 nm处吸光度[15-16]，计算MAP型聚氨酯黏合材料对EVC304细胞的24 h增殖抑制率：细胞增殖抑制率=(1-吸光度实验组/吸光度对照组)×100%，得到细胞增殖抑制曲线，如图6所示。

黏合材料质量浓度/(μg·L-1)

由图6可以看出，MAP型聚氨酯黏合材料对EVC304细胞表现低毒性。聚氨酯合成材料在ECV304细胞中的增殖抑制作用随自身浓度增加而增大，就其浓度增幅的整体趋势而言，聚氨酯合成材料呈现低毒性[17]。

3 结 论

(1)基于MAP结构中邻二酚功能片段的黏合机制，进行聚氨酯材料的功能化修饰，合成得到MAP型聚氨酯黏合材料。

(2)合成得到的MAP型聚氨酯黏合材料聚合分布均匀，多分散指数接近于1，Mv为955，热失重曲线连续，热稳定性良好，温度高于150 ℃时出现热失重。

(3)所合成的MAP型聚氨酯黏合材料对体外活细胞表现低毒性，黏合材料质量浓度为4 000 μg/L时，其对ECV304细胞的24 h增殖抑制作用低于30%，具有进一步应用于生物医学领域的良好前景。