微波功率对蛋清蛋白粉乳化特性的影响

刘丽莉，史胜娟，吴红梅，丁 玥，程伟伟

(1河南科技大学 a食品与生物工程学院，b 食品加工与安全国家级实验教学示范中心，c 农产品干燥技术河南省教育厅科技创新团队，河南 洛阳 471023；2洛阳正大食品有限公司，河南 洛阳 471023)

蛋清蛋白粉由鲜鸡蛋清经干燥加工制成，作为鸡蛋清优良的代替品，蛋清蛋白粉因具有较好的加工特性且贮存方便而被广泛研究[1]。在蛋清蛋白粉生产加工过程中，干燥方式是影响其功能特性的重要因素之一，因此采用适当的干燥方式对鸡蛋清进行干燥处理，开发出具有更高品质的蛋清蛋白粉，对于拓展其应用领域具有非常重要的市场价值。目前，已有较多学者采用不同的方法对鸡蛋清进行干燥处理[2-4]。代晓凝等[5]采用多种干燥方式对鸡蛋清进行干燥处理，探究了不同干燥方式对蛋清蛋白凝胶特性和结构的影响；王洁等[6]采用真空冷冻技术干燥鸡蛋清，并分析总结了影响干燥过程的重要因素；孙卓等[7]利用超声处理辅助喷雾干燥技术制备速溶性蛋清蛋白粉，发现经超声处理后的蛋清蛋白粉颗粒细小而且均匀性增加，蛋白质结构趋于无序，这些变化都有利于提高蛋清蛋白粉的速溶性。

因蛋清蛋白具有良好的功能特性，因此在食物的质地和结构方面发挥着重要作用。目前关于蛋白的起泡性研究较多，张婷等[8]综述了蛋白起泡特性的相关机理以及生物酶解对蛋白起泡特性的影响因素，胡洁芳[9]研究了利用微波糖基化改性提高蛋清蛋白的起泡性，Wouters等[10]研究了面筋水解物和蛋清混合蛋白溶液的起泡及空气-水界面特征。而乳化活性作为蛋白质的另一个重要加工特性，在食品加工过程中也起着重要的作用[11]。现阶段关于乳化活性的研究多以蛋黄为主，但蛋黄中脂肪含量较多，相对于蛋黄而言，蛋白胆固醇含量较低，有利于预防心脑血管等疾病。因具有亲水基和疏水基，因此蛋白分子可均匀地分布在油-水混合体系中，降低表面张力，使水和油形成稳定的乳化液[12]。因此，蛋白的乳化活性是目前的研究热点。

目前，关于蛋白的乳化活性研究主要集中在对蛋白质的修饰及改性方面，而关于干燥处理对蛋清蛋白乳化活性的影响鲜见报道。刘丽莉等[13]对蛋白的功能特性有较多的研究，但大多集中在蛋白的凝胶性和起泡性等方面，关于乳化活性尚无较为全面的研究。前期研究发现，经冷冻干燥后的蛋清蛋白粉在溶解度和乳化活性方面有了明显提高[14]。因此本试验在前期试验的基础上，研究微波真空冷冻干燥功率对蛋清蛋白粉乳化特性的影响，为高品质干燥的蛋清蛋白粉应用于食品加工业提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜鸡蛋、大豆油，购于河南省洛阳市大张超市；十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)，美国Sigma公司；KBr(分析纯)，天津市光复经济化工研究所；Na2HPO4(分析纯)、NaH2PO4(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

微波真空冷冻干燥机，实验室自制；UV2600型紫外分光光度仪，日本日立公司；TM3030Plus电子扫描显微镜，日本岛津公司；VERTEX70傅里叶红外光谱仪，德国Bruker公司；Zetasizer Nano-ZS90 粒度仪及Zeta电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；Cary eclpise 荧光分光光度计，美国Aglient Cary elipse 公司；Leica DM2500型光学显微镜，徕卡显微系统贸易有限公司；FJ200-SH型数显高速分散均质机，上海标本模型厂。

1.3 试验方法

1.3.1 鸡蛋预处理 将鲜鸡蛋表面的污渍清洗干净，带壳消毒，晾干后分离蛋清蛋黄，搅拌蛋清液并在室温下自然发酵48 h进行脱糖，巴氏杀菌法杀菌后进行干燥处理。

1.3.2 微波真空冷冻干燥蛋清蛋白粉的制备 本研究所用的微波真空冷冻干燥机自制，设备原理参照段柳柳等[15]的研究。将蛋清液平铺于物料盘内，先在冰箱冷冻室预冻3 h。打开设备的制冷系统，待冷阱温度降至-40 ℃后放入物料，开启微波和真空泵。固定真空度为300 Pa，装载量为120 g，改变微波功率(100，200，300，400，500 W)，干燥至绝干。

1.3.3 蛋清蛋白粉乳液的制备 参考Wang等[16]的方法略作修改。称取0.2 g干燥蛋清蛋白粉样品，溶解于100 mL水中，25 ℃下1 000 r/min搅拌1 h。然后取搅拌好的蛋白溶液15 mL与5 mL大豆油混合，在高速乳化均质机下以13 500 r/min乳化2 min，得到蛋清蛋白粉乳液。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 乳化活性指数和乳化稳定性指数测定 在烧杯底部取20 μL蛋清蛋白粉乳液，与5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液均匀混合，分别于混合后0，10 min在500 nm处测定吸光度值。以0.1% SDS作空白对照。乳化活性指数(emulsifying activity index,EAI)和乳化稳定性指数(emulsifying stability index,ESI)计算公式为:

(1)

(2)

式中：EAI为乳化活性指数，m2/g；T=2.303，为固定常数；A0为混合0 min的吸光度值；N为稀释倍数，取250；C为蛋清蛋白粉乳液形成前蛋白质水溶液中蛋白质的质量浓度，g/mL；φ为乳液中油相的体积分数，φ=0.25；ESI为乳化稳定性指数，min；A10为混合10 min的吸光度值。

1.4.2 Zeta电位测定 先将样品用10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)稀释50倍，乳液的相对折射率设置为1.450，采用Zeta电位分析仪在室温下测定3次。

1.4.3 粒径测定 利用激光粒度仪测定样品的粒径。取乳液100 μL用蒸馏水稀释50倍，在25 ℃下平衡2 min后开始测试，每个样品平行测定3次。

1.4.4 浊度测定 采用Kurganov等[17]的方法，将处理后的蛋白样品用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L)进行稀释，使其质量浓度为2 mg/mL，用旋涡振荡器将其混合，在400 nm处测定其吸光度(OD400)，用所得OD400值表示浊度。

1.4.5 内源荧光光谱 根据Ye等[18]的方法，取120 μL乳液样品溶于8 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中，充分振荡，设定激发波长为290 nm，采用高电压800 V，扫描发散光谱范围310～400 nm，激发和发射狭缝宽均为5 nm。

1.4.6 扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)分析 取微量待测样，用导电银胶粘到扫描电镜样品台上，置于扫描电镜下观察样品的微观结构。

1.4.7 傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析 将处理后的蛋白样品进行冷冻干燥，取1 mg样品和少量溴化钾粉末混合磨粉并压制成片，用傅里叶变换红外光谱进行全波段扫描，设定参数为扫描次数32，测量波数4 000～500 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.4.8 光学显微镜观察 取一滴制备好的新鲜乳液样品，滴在载玻片上，然后盖上盖玻片放置于显微镜载物台上，用10倍光学显微镜观察，采集的图像由连接到电脑的数字图像处理软件获得。

1.5 数据处理与分析

试验测定结果均做3次重复，试验数据利用Origin 8.5软件绘图，用DPS软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 微波功率对蛋清蛋白粉乳化活性和乳化稳定性的影响

乳化活性和乳化稳定性是蛋白质重要的加工特性，具有形成乳化液和维持乳化状态的能力[19]。图1为不同功率微波对蛋清蛋白粉乳化活性和乳化稳定性的影响。由图1可知，蛋清蛋白粉的EAI和ESI均随微波功率的增高呈先上升后下降的变化趋势(P<0.05)，当微波功率为100 W时，蛋清蛋白粉的EAI和ESI分别为34.40 m2/g和26.92 min；在微波功率为300 W时，蛋清蛋白粉的EAI和ESI均达到最大值，分别为62.35 m2/g和33.53 min；随后随着微波功率的增加蛋清蛋白粉EAI和ESI开始下降。这是因为适度的微波作用导致蛋清蛋白之间的氢键和范德华力受到破坏，蛋清蛋白结构变得更加松散，内部包埋的基团暴露，提高了蛋白质对脂肪的吸附能力[20]。Yalcin[21]等研究发现，微波处理小麦面筋蛋白的乳化活性也得到了提高，这与本研究结果相一致。

图中不同小写字母表示不同功率样品间差异显著(P<0.05)。下同Different lowercase letters show the significant difference among samples (P<0.05).The same below图1 微波功率对蛋清蛋白粉乳化活性和乳化稳定性的影响Fig.1 Effect of microwave power on emulsification and emulsification stability of egg white protein powder

2.2 微波功率对蛋清蛋白粉Zeta电位的影响

Zeta电位可以反映蛋清蛋白粉乳液的稳定性，液滴表面的电荷可以在液滴之间产生较大的排斥力以维持乳液稳定。图2为不同功率微波下蛋清蛋白粉乳液的Zeta电位。由图2可知，随着微波功率的增加，蛋清蛋白粉乳液的Zeta电位绝对值先增加后减小(P<0.05)。当微波功率为300 W时，蛋清蛋白粉乳液Zeta电位的绝对值最大，为41.35 mV。当微波功率高于300 W时，蛋清蛋白粉乳液Zeta电位的绝对值开始减小；微波功率为500 W时，Zeta电位绝对值最小，为29.57 mV。这可能是因为适度的微波处理导致乳液界面处吸附的蛋白质含量增加所致。Sun等[22]研究表明，增大蛋白质浓度会导致其表面负电荷更多，即Zeta电位绝对值更大。综上所述，适度的微波辐照可增加蛋清蛋白粉乳液的Zeta电位，提高乳液的稳定性；过高的微波辐照可减小乳液的Zeta电位，进而降低其稳定性。

图2 微波功率对蛋清蛋白粉乳液Zeta电位的影响Fig.2 Effect of microwave power on Zeta potential of egg white protein powder

2.3 微波功率对蛋清蛋白粉平均粒径及粒径分布的影响

粒径是间接反映蛋白质结构变化的指标，粒径分布可以充分反映样品溶液中粒子的大小和均匀性[23]。一般来说，液滴粒径越小乳液体系稳定性越好[24]。图3为不同功率微波处理下蛋清蛋白粉的平均粒径和粒径分布。

图3 微波功率对蛋清蛋白粉平均粒径及粒径分布的影响Fig.3 Effects of microwave power on average particle size and particle size distribution of egg white protein powder

由图3-A可知，蛋清蛋白粉乳液的平均粒径随微波功率增加呈先降低后增加的变化趋势，在微波功率为300 W时，蛋清蛋白粉乳液的平均粒径最小，为1 203.67 nm；当微波功率进一步增大后，蛋清蛋白粉乳液的平均粒径显著增加，这可能是过高的微波功率使蛋白质聚集形成聚集体，蛋白分子粒径变大[25]，导致其平均粒径增加，EAI和ESI降低。

由图3-B可知，微波功率为300 W时，蛋清蛋白粉乳液粒径分布呈现单峰曲线，其余功率则呈现多峰分布，这表明微波功率为300 W时，蛋清蛋白质更均匀地分散在溶液体系中[26]。

2.4 微波功率对蛋清蛋白粉浊度的影响

浊度是表征蛋白质聚集程度的关键指标，能从侧面反映蛋白在溶液中的分散状态[27]。为进一步证明微波功率变化会引起蛋白质分子聚集及粒径大小的改变，对蛋清蛋白粉的浊度进行测定。图4为微波功率对蛋清蛋白粉浊度的影响。由图4可知，当微波功率较低时蛋清蛋白粉浊度较小；当微波功率超过300 W后，蛋清蛋白粉浊度随微波功率的增加呈显著增大趋势(P<0.05)。这可能是因为过高功率的微波辐射使蛋白质在干燥过程中发生交联和聚集，颗粒较大，导致浊度增加[28]。Cromwell等[29]研究表明，溶液中聚集体数量和大小会影响样品的浊度。400和500 W处理后的蛋清蛋白粉乳液样品的浊度显著增加，这与其粒径显著增大的结果相互佐证，表明蛋清蛋白粉乳液经较高微波功率处理后形成了聚集体，导致乳液的ESI降低。

图4 微波功率对蛋清蛋白粉浊度的影响Fig.4 Effect of microwave power on turbidity of egg white protein powder

2.5 微波功率对蛋清蛋白粉内源荧光光谱的影响

内源荧光光谱可判断蛋白构象变化，通过分析光谱变化反映出侧链的变化。蛋白质的内源荧光主要来源于对微环境变化较为敏感的色氨酸(Trp)[30]。图5为不同功率微波处理对蛋清蛋白粉乳液内源荧光光谱的影响。

图5 微波功率对蛋清蛋白粉内源荧光光谱的影响Fig.5 Effect of microwave power on endogenous fluorescence spectrum of egg white protein powder

由图5可知，不同功率微波处理后,蛋清蛋白粉乳液的内源荧光光谱形状未发生改变，但荧光强度发生了明显变化。随微波功率的增加，荧光强度逐渐减弱，500 W微波功率处理的蛋清蛋白粉乳液λmax处的内源荧光强度相比100 W微波处理降低20.67%，且λmax从338 nm移至334 nm。这可能是因为微波功率过高，蛋白分子发生聚合沉淀，使暴露在蛋白分子表面的Trp残基被包裹在蛋白分子内部，导致蛋白荧光强度降低[31]，造成粒径变大，浊度增加，从而导致蛋清蛋白粉乳液的EAI和ESI降低。

2.6 不同功率微波下蛋清蛋白粉乳液的扫描电镜图

从图6可以看出，在2 000倍放大倍数下，100 W处理下的蛋清蛋白粉比较规整，结构紧密，局部有细微的孔眼，质地饱满，颗粒的大小不均匀，表面有光泽；当微波功率为200 W时，蛋清蛋白粉表面展开，孔眼增加且较深；微波功率为300 W时，蛋清蛋白粉表面展开程度增大，颗粒的大小均匀，质地疏松。这可能是适度功率微波处理可使深埋在蛋白分子内部的侧链基团暴露出来，分子柔韧性增强，蛋白分子在界面上的展开与形态改变更容易些[32]。这使得微波适度功率辐照可提高蛋清蛋白粉乳化活性的微观原因得到了很好的直观说明。继续增大微波功率(400～500 W)，蛋清蛋白粉表面的舒展程度较差，这可能是过高功率的微波处理，通过极性分子的摩擦作用加剧了蛋白间的相互作用，导致蛋白结构变得粗糙且更加不规则，乳液的EAI和ESI降低。

图6 微波处理后蛋清蛋白粉乳液的扫描电镜图(×2 000)Fig.6 Scanning electron microscopy of egg white protein powder after different microwave treatments

2.7 不同功率微波下蛋清蛋白粉的红外光谱分析

图7为不同功率微波处理后的蛋清蛋白粉FT-IR图谱。从峰位变化分析，300 W处理后蛋清蛋白粉的酰胺I带为1 655.61 cm-1，相较于其他功率的蛋清蛋白酰胺I带向高波数方向发生了红移。说明微波干燥功率使蛋白质分子中的二级结构单元组成峰位发生了位移变化[33]。

图7 不同功率微波处理后蛋清蛋白粉的红外光谱图Fig.7 FTIR spectra of egg white protein powder under different microwave power

表1为通过红外光谱分析得到的微波冷冻干燥处理后蛋清蛋白粉的二级结构组成。由表1可知，随着微波功率的增大，蛋清蛋白粉二级结构中各组成的含量发生显著变化，其中α-螺旋相对含量显著降低(除200 W外)，β-转角相对含量先增加后降低。

多肽链上羰基和氨基之间的氢键是维持α-螺旋稳定的主要作用力[34]，微波功率为500 W时蛋清蛋白粉二级结构中的α-螺旋含量降到最低，可能是因为微波功率过高，辐射能较多，导致蛋清蛋白粉发生解螺旋现象，从而造成α-螺旋结构含量降低[35]。300 W处理的蛋清蛋白粉二级结构中β-转角含量显著增加，可能是因为适当功率的微波辐射，使得蛋白质结构更加舒展，从而造成β-转角结构含量增加[36]。蛋白结构的展开有利于包裹在蛋白分子内部的基团暴露出来，表面活性增强，从而提高其乳化特性。

表1 不同功率微波处理后蛋清蛋白粉的二级结构含量(红外光谱)Table 1 Secondary structure fractions of egg white protein powder (FT-IR) under different microwave power

2.8 不同功率微波下蛋清蛋白粉显微镜观察结果

利用光学显微镜可以明显观察到不同功率微波处理下样品的微观结构变化。由图8可知，在相同的放大倍数(×10)下，不同功率微波处理下蛋清蛋白粉乳液的液滴明显不同。100～400 W处理下蛋清蛋白粉乳液的液滴直径较小，均匀性相对较好。其中，300 W处理下蛋清蛋白粉乳液的液滴直径最小，且分布最为均匀，这与上文提到的300 W处理下蛋清蛋白粉乳液的EAI和ESI较高，平均粒径较小，浊度较小相一致。当微波功率为500 W时，蛋清蛋白粉乳液的液滴直径较大，液滴出现聚集现象，因此其对应的ESI较低，平均粒径增大，浊度增加。

3 结 论

微波真空冷冻干燥功率对蛋清蛋白粉乳化特性影响显著，随着微波功率的增加,改变了蛋清蛋白粉中蛋白质分子的构象，进而影响蛋清蛋白粉的乳化活性和乳化稳定性。当微波功率为300 W时，蛋清蛋白粉乳液的EAI、ESI值和Zeta电位值最大，平均粒径最小，且此时蛋清蛋白粉的微观结构疏松，乳液液滴大小均匀。但当微波功率过高时，加剧了蛋白间的相互作用，蛋白的舒展程度较差，从而使蛋白结构变得粗糙且更加不规则，并且乳液的液滴直径较大，进而引起乳液的EAI和ESI值较低。