菰黑粉菌遗传转化体系启动子的筛选

卞加慧,胡映莉,汤近天,夏文强,叶子弘,张雅芬

(中国计量大学 生命科学学院 浙江省生物计量与检验检疫技术重点实验室,浙江 杭州 310018)

黑粉菌(smut fungi)是黑粉菌目寄生真菌的总称,因其孢子成熟时呈黑色粉末状孢子而得名。黑粉菌是一类重要的植物病原菌,也是重要的资源真菌。对黑粉菌的研究主要包括其致病机理及其作为微生物资源的开发利用,如黑粉菌生活史及致病因子、次生代谢物的合成、生物催化酶的鉴定、在生物质降解中的应用、作为蛋白质表达平台，等等[1]。由于菌种的差异,特异性启动子的筛选是开展上述分子机理研究及功能开发应用的关键。

玉米黑粉菌(UstilagoMaydis)是玉米上的重要病原真菌,并且也是研究寄主-病原物互作关系的模式生物[2],其启动子的研究比较深入。已发现启动子Padi1和Pitp1非常适合于诱导基因表达以响应氮素的限制,与衣康酸生产阶段相结合,这有助于进一步提高玉米黑粉菌的有机酸产量[3]。在玉米黑粉菌中,匹配型基因的调控对于二态转换和随后的致病发展至关重要,启动子Prf1的中心区域含两个不同的磷酸化位点,并且根据其磷酸化状态,能够激活不同交配型基因[4]。启动子Pmig2～5活性依赖于多种作用元件,这可能为可能的转录激活因子的协同作用提供了一个平台[5],刘芬利用Pmig2～5启动znf9基因过表达,获得znf9基因过表达玉米黑粉菌株,发现菌株的孢子形态发生改变,孢子的分裂增殖受到阻滞,推测znf9蛋白在细胞分裂过程中发挥一定的作用[6]。同源启动子也可用于黑粉菌遗传研究,颜梅新利用玉米黑粉菌启动子Pgdp构建了甘蔗鞭黑粉菌含GFP与RFP的双色成像系统[7]。除此之外,异源启动子也可用于构建黑粉菌遗传表达载体,Vijayakrishnapillai L等人利用异源启动子Potef驱动Ptn1在玉米黑粉菌中过表达,发现其过表达对致病力没有实质性影响[8]。但真菌是一个高度多样化的微生物种群,虽然存在不同类型的基因表达工具,但通常它们充其量只能在一个或几个密切相关的物种中发挥作用,并且随着新的宿主被引入研究和工业应用,它们的内源强启动子往往是建立功能性基因表达系统的第一候选者[9]。随着基因组测序技术的发展,越来越多的转录数据为我们研究启动子提供了一个非常有价值的宝盒,可用来识别具有所需表达动力学的启动子,从理论上讲,这使得能够建立量身定制的表达系统[10]。

菰黑粉菌(UstilagoesculentaP. Henn.)是黑粉菌属专性寄生的二态性真菌,侵染菰(Zizanialatifolia)后,在菰茎部形成的可食用肉质茎茭白[11],同时由于菌群分化,田间出现了肉质茎白嫩可食用的“正常茭白”以及肉质茎布满褐色孢子的不可食用的“灰茭”[12-13]。茭白是我国重要水生蔬菜,分布广泛,主要集中在长江中下游一带的浙江、江苏、上海、安徽等省,其中浙江省是全国茭白最大优势产区,近几年种植面积稳定在2.7万公顷左右,年产量约80万吨[14]。目前,菰黑粉菌菌群的差异性及其对茭白表型的影响机制、菰黑粉菌与茭白植株互作机理等尚不明确,从而导致茭白的生产、品质调控及育种等全靠经验指导,出现了品种退化、产量不稳定、品质差异大等问题,因此对“茭白”产生过程中植株与菰黑粉菌互作的分子机制研究迫在眉睫。其中,一个高效的基因表达系统是有效地研究目标基因功能的基本保障。目前主要采用的是异源启动子Potef构建的表达系统[15],虽然其驱动的eGFP能够在菰黑粉菌菌株内正常表达,但表达量不高,荧光信号不稳定,因此需要筛选出一个高效稳定表达的内源强启动子,为菰黑粉菌功能性基因研究及其与茭白互作机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与方法

1.1.1 菌株、质粒及培养条件

供试菌株:栽培茭白品种“龙茭2号”的灰茭中分离的性亲和单倍体菌株UeT55(a2b2 CCTCC AF 2015015),由本课题组分离,保藏[16],在YEPS培养基(酵母抽提物1%、蛋白胨2%、蔗糖2%、pH自然)中28 ℃进行培养。转化菌株在山梨醇再生培养基(酵母抽提物1%、蛋白胨0.4%、蔗糖0.4%、山梨醇18.22%、5 μg/mL萎锈灵)上进行筛选。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α(TaKaRa,日本),在LB培养基(酵母抽提物0.5%、蛋白胨1%、氯化钠1%、pH自然)中37 ℃进行培养。若上述培养基为固体培养基,则另外加入琼脂1.5%。载体质粒:实验室前期改造的没有核定位序列的pUMa932-eGFP质粒,含有(Amp抗性);萎锈灵(Cbx抗性);eGFP绿色荧光蛋白报告基因(由德国杜塞尔多夫大学惠赠)[17]。

1.1.2 酶和试剂

限制性内切酶NdeⅠ、KpnⅠ、NcoI、PvuI(NEB);ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit(C112-01,Vazyme,南京);Max Super-Fidelity DNA Polymerase(P505-d1,Vazyme,南京);柱式真菌RNA抽提纯化试剂盒(Sangon Biotech,上海);HiPure Plasmid EF Mini Kit去内毒素质粒小量中提试剂盒(Magen,上海);HiPureGel Pure DNA Kits凝胶DNA小量回收试剂盒(Magen,上海);HiScript®IIQ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(R223-01,Vazyme,南京);ChamQ SYBR qPCR Master Mix(q711,Vazyme,南京)。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的构建及遗传转化

提取菰黑粉菌UeT55 DNA作为模板,设计特异性引物,并在各连接片段的5′端与3′端加20 bp同源臂(表1),进行不同长度启动子的靶标基因扩增。PCR采用50 μL反应体系,包括引物F/R(10 μmol)各自1 μL,2×Phanta Max Buffera25 μL,dNTP Mix(10 mmol each)模板DNA 100 ng,1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase,加ddH2O补齐至50 μL。PCR反应程序:预变性95 ℃ 3 min;变性95 ℃ 15 s,退火15 s,延伸72 ℃ 30 kb·min-1,35个循环;彻底延伸72 ℃ 5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,呈现单一条带,用HiPure Gel Pure DNA Kits凝胶DNA小量回收试剂盒清洁回收,回收产物待用。

表1 载体构建和基因表达引物及其序列Table 1 Primer sequences for plasmid construction and gene expression

使用限制性核酸内切酶NcoI与KpnⅠ双酶切质粒pUMa932-eGFP,切除原有启动子Potef,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,使用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit凝胶DNA小量回收试剂盒对酶切后的大片段进行回收。

使用ClonExpress II One Step Cloning Kit C112无缝连接克隆试剂盒将获得的不同启动子目标条带与酶切后的载体大片段进行连接(图1)。然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞中,在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性转化子,阳性转化子扩大培养,并用特异性通用引物pUe-F/pUe-R(表1)对质粒进行菌液PCR验证,经1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果无误的质粒送测序公司测序,由此获得菰黑粉菌转化表达载体pUe-hsp-egfp、pUe-ef-egfp,pUe-cox12-egfp、pUe-mdh1-egfp、pUe-mix17-egfp、pUe-eno-egfp、pUe-qcr8-egfp、pUe-mia40-egfp、pUe-sti1-egfp、pUe-odc2-egfp。

图1 载体构建示意图Figure 1 Schematic diagram of plasmid construction

对构好的菰黑粉菌转化表达载体以及pUMa932-eGFP质粒进行单酶切线性化,除pUe-hsp-egfp使用NdeI,其余载体均使用PvuI进行单酶切,酶切产物纯化回收,回收片段通过PEG介导的原生质体转化法转进菌株UeT55的原生质体,涂布于含5 μg/mL萎锈灵的再生培养基上,将其置于28 ℃培养箱培养5 d后,挑取转化子后在含5 μg/mL萎锈灵的YEPS固体培养基上培养,然后在荧光显微镜下观察eGFP绿色荧光蛋白是否表达,筛选获得转化子[15],挑取转化子在荧光显微镜下观察荧光进行筛选,鉴定阳性转化子。

1.2.2eGFP基因的荧光定量PCR检测

用柱式真菌RNA抽提纯化试剂盒提取阳性转化子总RNA,用PrimeScriptTM 1 st Strand cDNASynthesis Kit反转录试剂盒得到样品的cDNA。使用Clone Manager设计eGFP荧光定量引物Qegfp-F/R,以β-actin为内参[18],利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行检测,测定基因表达。荧光定量PCR反应体系和反应程序参照[19],每个样品设置三个重复。相对基因表达量采用2-ΔΔCt的方法[20]计算,并使用相关软件进行数据分析。

1.2.3eGFP荧光强度评价

挑取阳性转化子单菌落于20 mL YEPS液体培养基,28 ℃,180 r/min小摇24 h,按照1∶100的比例吸取500 μL小摇菌液至50 mL YEPS液体培养基,28 ℃,180 r/min扩摇12 h[21],吸取5 μL阳性转化子扩摇产物于载玻片上,利用荧光显微Leica DM6 B,在白光和荧光双通道固定拍照参数条件下进行拍照,每个阳性转化子随机拍三张图,利用Image J软件打开图片进行分析,计算每个细胞的荧光强度[22]。

2 结果

2.1 启动子基因片段的获得

根据实验室前期对T型菌株融合及侵染过程的转录组测序结果,通过基因组比对后的序列文件进行转录本定量,使用每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片即FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)为基因表达的标准,对基因进行定量分析。基于RNA-Seq的转录水平FPKM值,T型菌融合0 h、24 h、36 h、48 h、60 h 5个时间点基因的FPKM,以及T型菌侵染茭白植株1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 5个时间点茎尖内菰黑粉菌基因的FPKM,结合真核生物启动子数据库(EPD)中已报道的启动子进行筛选,筛选10个启动子作为研究对象(表2),包括Phsp、Pef、Pcox12、Pmdh1、Pmix17、Peno、Pqcr8、Pmia40、Psti1、Podc2。

表2 根据FPKM值筛选的高强度启动子基因Table 2 High intensity promoter genes screened according to FPKM value

其中Phsp(hsp70编码热休克蛋白70),Pef(ef1α编码延伸因子1-α)的FPKM均值较高,为高表达基因,Pcox12(cox12编码细胞色素c氧化酶Ⅵ b亚基),Pmdh1(mdh1编码线粒体苹果酸脱氢酶),Pmix17(mix17编码线粒体膜间隙蛋白),Peno(eno编码烯醇化酶),Pqcr8(qcr8编码泛醇细胞色素c还原亚基8),Pmia40(mia40编码线粒体氧化还原酶),Psti1(sti1编码Hsp90辅助伴侣),Podc2(odc2编码线粒体内膜转运蛋白)。所选取的10个启动子大多数是管家基因,参UeT55基因组的序列信息,并使用真核生物基因预测软件FGENESH(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fgenesh & group=programs & subgroup=gfind),选择Ustilago(smuts)作为基因组特异性参数,对基因结构进行预测,确定挑选的10个基因的启动子片段区域。

选取10个启动子长度分别为928 bp(Phsp)、1 314 bp(Pef)、350 bp(Pcox12)、397 bp(Pmdh1)、445 bp(Pmix17)、507 bp(Pqcr8)、666 bp(Pmia40)、644 bp(Psti1)、338 bp(Podc2)。根据(表1)各启动子特异性引物扩增出10个启动子,通过凝胶电泳检测,各启动子片段长度与预期相符(图2)。后续构建菰黑粉菌转化表达载体,经测序验证,启动子片段测序结果与原序列一致。

图2 启动子基因片段扩增Figure 2 Amplification fragments of promoters

注: —正义链上CAAT-box; —反义链上CAAT-box; —正义链上TATA-box; —反义链上TATA-box图3 启动子序列元件特征Figure 3 Characterization of promoter sequences and elements

2.2 启动子序列与元件分析

在真核生物启动子元件中,TATA-box是RNA聚合酶结合处之一,与取向无关,帮助RNA聚合酶识别启动子,与转录起始有关;CAAT-box控制着转录起始的频率,正反取向都能发挥作用。通过启动子在线分析软件PlantCARE(http://bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/),对扩增获得的启动子序列中作用元件TATA-box和CAAT-box进行分析。结果如图3:在启动子Phsp中存在7个CAAT-box和1个TATA-box;在启动子Pef中存在15个CAAT-box;在启动子Pcox12中存在5个CAAT-box;在启动子Pmdh1中存在3个CAAT-box,1 TATA-box;在启动子Pmix17中存在6个CAAT-box;在启动子Peno中存在1个CAAT-box,1个TATA-box;在启动子Pqcr8中存在5个CAAT-box,1 TATA-box;在启动子Pmia40中存在4个CAAT-box,2个TATA-box;在启动子Psti1中存在4个CAAT-box,1 TATA-box;在启动子Podc2中存在5个CAAT-box。

2.3 菰黑粉菌遗传转化及转化子筛选

通过PEG介导原生质体转化,在含有cbx抗生素的培养基上筛选转化子,然后在荧光显微镜下观察eGFP的荧光蛋白是否表达,筛选出阳性转化子。成功获得UeT55-Potef-eGFP,UeT55-Phsp-eGFP,UeT55-Pef-eGFP,UeT55-Pcox12-eGFP,UeT55-Pmdh1-eGFP,UeT55-Pmix17-eGFP,UeT55-Peno-eGFP,UeT55-Pqcr8-eGFP,UeT55-Pmia40-eGFP,UeT55-Psti1-eGFP,UeT55-Podc2-eGFP转化菌株各5株,将获得的转化菌株在不含萎锈灵的YEPS固体培养基上连续继代5次,再转接至含有5 μg/mL萎锈灵的YEPS固体培养基内培养48 h后,转化菌株仍能正常生长,保持了和野生型UeT55相似的菌落形态,荧光观察稳定(图4),说明插入到菰黑粉菌基因组中的各启动子与eGFP基因均能够稳定遗传。

2.4 不同启动子驱动eGFP基因表达水平

以UeT55中β-actin作为内参基因,通过荧光定量PCR来检测eGFP基因的表达量。并使用SAS软件进行数据分析,采用单因素方差分析分析数据,不同字母表示不同启动子驱动eGFP表达能力存在显著性差异(p<0.05)。结果如图5所示,启动子Phsp,Pef,Pcox12驱动eGFP基因表达能力显著高于外源启动子Potef,分别高于对照9倍,5倍,2倍以上,启动子Pmdh1、Pmix17、Peno、Pqcr8驱动eGFP基因表达能力与外源Potef无显著差异,而启动子Pmia40、Psti1、Podc2驱动eGFP基因表达能力显著低于Potef。

注:Bright:白光通道下拍摄;Green:绿色荧光通道下拍摄;Merged:所有通道重叠,Bar=49.4 μm图4 11个启动子驱动eGFP在UeT55菌株内表达的荧光观测Figure 4 Fluorescence observation of eleven promoters driving eGFP expression in UeT55

注:图中误差线表示标准误差,不同字母表示差异显著(P<0.05),下同。图5 各启动子控制的eGFP基因表达水平Figure 5 Expression levels of eGFP gene controlled by each promoter

2.5 转化子菌体的荧光检测

使用荧光显微镜对阳性转化子进行拍照,利用Image J测量每个转化子细胞平均荧光强度,结果如图6所示,结果与荧光定量PCR结果一致,启动子Phsp,Pef,Pcox12驱动eGFP基因表达荧光强度显著高于外源启动子Potef,分别高于对照6倍,4倍,1.5倍以上,Phsp启动子驱动表达的eGFP的荧光强度范围是36.79～42.14,平均强度为39.73;Pef启动子驱动表达的eGFP荧光强度范围是23.67～27.98,平均强度为25.14;Pcox12启动子驱动表达的eGFP的荧光强度范围是11.07～14.22,平均强度为12.16;异源启动子Potef启动子驱动表达eGFP荧光强度范围是4.12～8.15,平均强度为6.15;启动子Pmdh1、Pmix17、Peno、Pqcr8驱动eGFP基因表达荧光强度与外源Potef无显著差异,而启动子Pmia40、Psti1、Podc2驱动eGFP基因表达荧光强度显著低于Potef。

图6 各启动子驱动eGFP表达的荧光强度Figure 6 Fluorescence intensity of eGFP expression driven by each promoter

3 讨 论

近年来对黑粉菌的研究侧重于基础研究与应用科学相结合,为未来的生物技术应用提供了坚实的理论基础。随着基因组测序技术的发展,和越来越多黑粉菌测序工作的完成,2006年完成玉米黑粉菌测序[23],2010年完成玉米丝孢堆黑粉菌测序[24],2012年完成大麦坚黑粉菌测序[25],2014年完成甘蔗鞭黑粉菌测序等[26]。并逐渐开始基因组数据挖掘和比对基因组学研究,对黑粉菌遗传转化体系建立的研究也更深入[27],为后续基因功能基础研究奠定了重要的基础。启动子是控制基因转录的重要元件,是功能基因正常表达的重要前提,使用合适的启动子是提高转化效率的关键,是建立高效稳定分子转化体系过程中的关键组成部分。

在前期研究中,我们利用异源启动子Potef构建菰黑粉菌遗传表达体系,虽然能够启动基因表达,但其启动能力一般,遗传效率低,遗传稳定性不高。目前,国内外有关菰黑粉菌启动子的研究未见报道,因此,菰黑粉菌启动子的研究十分必要。基于RNA-seq结果,使用FPKM可以系统的定量基因的表达水平,近年来已被用于系统筛选强启动子元件[28-29]。胡于东从工业菌株G.oxydansWSH-003全基因组水平上进行筛选,得到一系列梯度强度组成型启动子[30]。2017年本课题组完成对菰黑粉菌整个基因组的测序,并对该真菌及其宿主的转录本进行测序和分析[31]。后续,我们课题组对菰黑粉菌生活史的多个时间点进行转录组测序分析,可以反映每个基因不同时期的转录水平和转录模式,从而可以帮助筛选各类所需的启动子元件。本研究基于以上基础,筛选出10个启动子,以pUMa932为基础载体,将启动子Potef替换成筛选出的10个启动子构建相关载体,通过PEG介导原生质体转化构建UeT55表达eGFP菌株,基于qRT-PCR和Image J分析结果,进一步筛选出三个内源强启动子,Phsp、Pef、Pcox12驱动eGFP表达能力和稳定性均高于异源启动子Potef,意味着菰黑粉菌的内源启动子具有巨大的开发潜力。其中Phsp启动能力最强,遗传转化效率最高,易于操作,适用于后期基因功能研究,也为后期菰黑粉菌高效表达外源蛋白提供了可能性。

4 结 论

本研究得到的菰黑粉菌内源启动子Phsp,Pef,Pcox12表达能力强,表达稳定,具有较好的应用前景,从而丰富了菰黑粉菌内源启动子研究。其中利用Phsp启动子构建的遗传表达载体,表达能力最强,稳定性最高,插入的eGFP能够稳定遗传,适用于后期的基因功能分析研究。