急性脑梗死患者血清miR-15b、miR-19a和VEGF水平与颈动脉狭窄程度的相关性分析*

王朝刚,张晓曼,徐晓玉

(郑州市第一人民医院，河南 郑州 450004)

急性脑梗死(Acute cerebral infarct, ACI)是由于供应脑部血液的动脉出现粥样硬化或血栓引起血管腔狭窄、闭塞，导致局部脑组织供血不足而产生的脑组织软化、坏死。颈动脉颅外狭窄是指颈总动脉和颈内动脉的狭窄和闭塞，是ACI发生及病情进展的重要原因[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)可促进新生血管生成和动脉斑块形成，造成动脉硬化、狭窄[2]。miRNA是一种稳定存在于血浆、血清样本中的无编码功能单链RNA，可干扰游离mRNA翻译，调控基因表达，对细胞分化、增殖和凋亡过程具有调节作用[3]。有研究显示，miR-15b和miR-19a是广泛存在于机体血管内皮系统的miRNA，可诱导血管内皮增殖、形成，与血管内皮功能密切相关[4]。本研究主要探讨ACI患者血清miR-15b、miR-19a表达及VEGF水平变化，旨在分析其与颈动脉狭窄程度的相关性。

1 对象与方法

1.1对象 纳入标准：(1)符合ACI诊断标准[5]，ACI合并颈动脉颅外段狭窄组有短暂性缺血发作、可逆性缺血性神经功能障碍和缺血性卒中等症状，经CTA检查确诊颈动脉颅外段狭窄[6]；(2)发病48 h内入院；(3)首次发病，且入组前未接受介入或溶栓等相关治疗。排除标准：(1)合并严重心、肝、肾等脏器功能不全及其他免疫性相关性疾病；(2)合并颅内出血、感染或肿瘤；(3)合并ACI意外的其他脑血管异常；(4)无法配合颈动脉超声检查。

选取2020年1月-12月在本院确诊的130例ACI患者作为ACI组，根据颈部超声检查有无颈动脉颅外段狭窄分为ACI无颈动脉颅外段狭窄组(n=45)和ACI合并颈动脉颅外段狭窄组(n=85)；根据CT血管造影(CT angiography，CTA)颈动脉狭窄程度将ACI合并颈动脉颅外段狭窄组患者为轻度狭窄组(n=37)、中度狭窄组(n=28)和重度狭窄组(n=20)。ACI组男性73例，女性57例，年龄45～75岁，平均(57.32±5.95)岁。选取本院同期行健康体检并经颈动脉超声检查和头颅MRI证实无异常的110例成人作为正常对照组，男性59例，女性51例，年龄45～73岁，平均(57.14±5.63)岁。两组患者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经郑州市第一人民医院医学伦理委员会批准，患者及家属了解并知情同意。

1.2检测方法 于入组次日清晨，采集空腹静脉血5 mL，离心后取上清，于-80℃保存备用。采用酶联免疫法检测血清VEGF水平，试剂盒由上海广锐生物科技有限公司生产，并严格按照使用说明书进行操作。

采用Trizol试剂盒提取总RNA并检测其纯度和浓度，采用逆转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA，反应产物稀释后作为qRT-PCR模板。使用实时荧光定量PCR仪进行引物扩增，每个样品设3个复孔。反应条件如下: 95 ℃预变热10 min、95 ℃ 15 s、55 ℃ 20 s、70 ℃ 20 s，如此循环40次。以U6为内参，引物序列见表1。用2-△△CT方法计算miR-15b、miR-19a的相对表达量。所有步骤均严格按照各仪器及试剂说明书进行。

表1 引物序列

1.3观察指标 比较ACI组和对照组血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a的相对表达量；比较轻度、中度及重度颈动脉颅外段狭窄组血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a的相对表达量。

1.4统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件进行分析，多组间比较采用SNK-q检验进行两两比较；相关性分析采用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1三组血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量比较 ACI合并颈动脉颅外段狭窄组血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量明显高于ACI无颈动脉颅外段狭窄组和正常对照组(P<0.05)。见表2。

表2 三组血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量比较

2.2三组血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量比较 重度狭窄组患者血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量明显高于中度狭窄组和轻度狭窄组(P<0.05)。见表3。

表3 轻度、中度及重度颈动脉颅外段狭窄组血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量比较

2.3血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量与ACI患者颈动脉颅外段狭窄程度的相关性分析 血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量与ACI患者颈动脉颅外段狭窄呈显著的正相关关系(r=0.278、0.213、0.219，P<0.05)。见表4。

表4 血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量与ACI患者颈动脉颅外段狭窄程度的相关性分析

3 讨论

颈动脉颅外段狭窄多由动脉粥样硬化引起，可导致颈动脉内膜增生，形成动脉斑块，引起颈动脉管腔狭窄和堵塞[7]。既往研究显示，合并颈动脉颅外段狭窄可增加ACI患者的致残率和致死率，对其预后造成严重影响[8]。因此，ACI发病后早期对是否发生颈动脉颅外段狭窄进行评估，及时采取相应的治疗措施，有利于改善患者治疗结局。miRNA在血管内皮细胞增殖、凋亡及侵袭过程中发挥重要的作用，既往有研究报道ACI患者血清中miR-155及miR-122表达谱发生改变，可能参与了ACI发生发展过程[9]，但少见ACI患者血清miR-15b、miR-19a和VEGF水平及其与颈动脉狭窄程度的相关性的报道。

本研究结果显示，ACI合并颈动脉颅外段狭窄组血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量明显高于ACI无颈动脉颅外段狭窄组和正常对照组，且重度狭窄组患者血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量明显高于中度和轻度狭窄组，说明血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量可能与ACI合并颈动脉颅外段狭窄患者的颈动脉狭窄程度有关。VEGF可改善血管通透性，导致血管发生硬化、狭窄，进而发生脑梗死。李生[10]、周雪姣[11]等研究发现， 血清miR-15b在ACI患者血清中呈高表达，miRNA-223相对表达量与无症状颅内动脉狭窄程度密切相关，与本研究结果类似，说明VEGF水平升高和miR-15b、miR-19a相对表达量增加与ACI患者发病及病情加重有关，三者水平值均随着病情程度的加重而升高，可作为反映颈动脉狭窄发生和狭窄程度的监测指标。

本研究中，Pearson相关分析结果显示，血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量与ACI患者颈动脉颅外段狭窄呈显著的正相关关系。VEGF是强效促血管生成因子，其血清含量升高可促进脑缺血组织部位新生血管生成，可有效缓解缺血性脑卒中。miRNA作为真核生物中非编码小分子单链RNA，均具有分子量小的特点，在不同组织中表达量差异较大[12-13]。王猛等[14]研究结果显示，冠心病患者血浆中miRNA-133,miRNA-208和miRNA-499表达水平与冠脉狭窄程度呈正相关。Polyakova等[15]研究发现，血清miRNA-203表达水平对应于心肌表达，与冠状动脉粥样硬化程度密切相关，与本研究结果类似。本研究中，血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量随ACI患者颈动脉颅外段狭窄严重程度增高而呈现升高趋势，且血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量与ACI患者颈动脉颅外段狭窄呈显著正相关，说明血清VEGF水平和miR-15b、miR-19a相对表达量的增高与ACI患者发病后颈动脉颅外段狭窄的发生密切相关，证实了其在监测ACI患者颈动脉颅外段狭窄程度中具有潜在的临床应用价值。具体分析，血管内皮损害引起的炎性细胞聚集和血管重塑可引起血管狭窄，是造成颈动脉狭窄的主要病因之一。miRNA可通过对脂质代谢的调节参与动脉狭窄的形成，在颈动脉狭窄的病理生理过程中发挥重要作用。miR-15b、miR-19a相对表达量与颈动脉狭窄程度相关，可能是由于miR-15b、miR-19a参与了血管内皮细胞功能调节和血管生成，而动脉狭窄程度不同的ACI患者存在不同程度的血管内皮功能损害，其血清表达水平可随动脉狭窄程度增高而呈现明显上升趋势，提示miR-15b、miR-19a可能参与了颈动脉狭窄程度的调控。本研究有望为临床治疗此类ACI患者颅外段颈动脉狭窄程度评估提供潜在的生物标志物，也可为临床研发靶向药物提供关键靶基因。

综上所述，ACI患者血清VEGF水平升高，miR-15b、miR-19a呈高表达，且与颈动脉狭窄程度的呈正相关。