miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究

王梽名，王宇豪，顾以韧，龙科任，李明洲，金 龙

(1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室，成都 610066)

脂肪沉积影响着猪肉的品质和生长效率，在猪生长发育中具有重要的意义。脂肪沉积依赖脂肪细胞数量的增加和体积的增大，而脂肪细胞内的脂滴不断聚集融合可使其体积增大[1]，因此解析成脂分化的分子机制对于调控猪脂肪沉积、改善猪肉品质以及畜牧业的生产有着非常重要的意义。

microRNA(miRNA)是一种具有调控基因表达功能的内源性单链非编码RNA，长度约为20～22 nt[2]。第一个被描述与脂肪生成相关的miRNA 是miR-143，它通过细胞外信号调节激酶(ERK5)调节脂肪生成[3]。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现参与脂肪生成，如miR-103、miR-30c和miR-375均可促进脂肪细胞分化[4-6]；而miR-244和miR-155均可抑制脂肪细胞分化[7-9]。miR-181家族的5个成员(miR-181a-1/2、miR-181b-1/2和miR-181d-5p)在大网膜组织中高度富集，这个家族对B细胞和T细胞的产生与发育都很重要，与炎症的产生息息相关[10]。顾以韧等[11]研究发现，miR-181a在猪脂肪组织中存在特异性高表达，Li等[12]研究也指出，miR-181a能够抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达，从而达到促进脂肪细胞成脂分化的目的。Jing等[13]研究发现，在高脂喂养的小鼠中miR-181d-5p特异性高表达，推测其可能与脂肪调控有关；Zhang等[14]研究结果表明，miR-181a通过直接靶向瞬时受体电位阳离子通道亚科V成员1(TGFBR1)促进脂肪细胞的分化。

鉴于miR-181a和miR-181d-5p在脂肪组织中特异性高表达[10-15]，但是缺乏对后续调控机制的深入探究，且未在猪的脂肪细胞上进行功能验证，本研究利用生物学信息方法预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，用实时荧光定量PCR检测其对脂肪分化调控基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和增强子结合蛋白α(C/EBPα)表达的影响，双荧光素酶报告基因试验验证其结合位点，研究miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞分化的影响，以期为提高猪肉的生产性能提供参考，对畜牧业动物新品种培育具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及样品采集 于四川省畜牧科学研究院随机选取3只7日龄雄性荣昌猪为试验动物，放血处死后迅速采取腿部肌肉和背部皮下脂肪组织样品，腿部肌肉和一部分背部皮下脂肪组织立即置于液氮中，-80 ℃保存备用；另一部分背部皮下脂肪组织用于分离脂肪细胞。本试验的所有动物试验都经过四川农业大学动物科技学院实验动物护理和使用委员会的批准。

1.1.2 主要试剂及仪器 地塞米松和重组牛胰岛素购自MCE公司；IBMX购自上海Sigma公司；DMEM高糖培养基、双抗(青-链霉素)、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、胎牛血清(FBS)等均购自Gibco公司；双荧光素酶试剂盒购自Promega公司；miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和HiScript®ⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒、Taqpro Universal SYBR qPCR Master Mix荧光定量试剂盒均购自诺唯赞生物科技股份有限公司。实时荧光定量PCR仪(CFX96)购自Bio-Rad公司。

1.1.3 生物材料合成 根据miRbase上miRNA的序列，运用化学方法合成本试验所用模拟物：miRNA mimics、inhibitor、阴性对照(NC)及靶基因siRNA均由生工生物工程(上海)有限公司合成；pmirGLO质粒载体购自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-181a和miR-181d-5p序列保守性分析 通过在miRBase(https:∥www.mirbase.org/)数据库下载猪、人、大鼠和小鼠的miR-181a与miR-181d-5p的序列，通过对各物种miRNA的种子序列(5′-端第2～8位碱基)进行比对，分析其序列保守性。

1.2.2 miR-181a和miR-181d-5p在肌肉和背部皮下脂肪组织的表达 参考NCBI和miRBase数据库中miR-181a、miR-181d-5p的序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物信息见表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根据Trizol法提取背部皮下脂肪、腿肌组织的总RNA，使用miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒和HiScript®ⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒进行反转录。以U6为内参，根据TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系10 μL：Premix ExTaqⅡ 5.0 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，RNase-free ddH2O补至10 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，共35个循环。采用2-△△Ct法计算各基因相对表达量。

表1 引物信息

1.2.3 miR-181a和miR-181d-5p靶基因筛选 采用miRandn(http:∥mirdb.org/)和TargetScan[16](http:∥www.targetscan.org/vert_70/)2个miRNA数据库预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，将2个数据库分别预测到的靶基因取交集以降低预测结果的假阳性，对获得的靶基因使用在线工具Metascape(https:∥bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)进行GO功能和KEGG通路注释。挑选与脂肪代谢相关的靶基因运用RNAhybrid[17]在线软件(http:∥metascape.org/gp/index.html#/main/step1)预测miRNA与靶基因的结合自由能，并将结合自由能<-87.8 kJ/mol的靶基因列为潜在靶基因。

1.2.4 miR-181a和miR-181d-5p与靶基因的靶向关系验证

1.2.4.1 靶基因载体构建 以pmirGLO为质粒载体，分别构建miR-181a和miR-181d-5p靶基因的野生型及突变型双荧光素酶载体，GPD2 3′-UTR 野生型质粒载体(GPD2-WT)和GPD2 3′-UTR突变型质粒载体(GPD2-MUT)；CREB1 3′-UTR 野生型质粒载体(CREB1-WT)和CREB1 3′-UTR突变型质粒载体(CREB1-MUT)。

1.2.4.2 猪前脂肪细胞的分离 将背部皮下脂肪用眼科剪剪成1 mm3大小之后用0.1%Ⅰ型胶原酶于37 ℃水浴消化70 min，之后将消化液过筛(70目)，过筛后置于离心管中1 200×g离心10 min，去掉上层漂浮的成熟脂肪细胞，过细胞筛后采用DMEM高糖培养基(DMEM+4% 双抗)重悬细胞。再次离心10 min后采用含有10%的胎牛血清(FBS)的完全培养基(DMEM+10% FBS+1% 双抗)重悬细胞。 将处理好的细胞接种于25 cm2的培养瓶中，于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.4.3 双荧光素酶报告基因试验 将分离的原代猪前脂肪细胞分为4组进行双荧光素酶报告基因试验，每组设置3个重复孔。 按照LipofectamineTM3000试剂盒方法分别将miR-181a mimics+GPD2-WT、miR-181a NC+GPD2-WT、miR-181a mimics+GPD2-MUT和miR-181a NC+GPD2-MUT共转染进培养的脂肪细胞中,同理miR-181d-5p和靶基因CREB1也以同样的方式转染脂肪细胞。具体转染方法：当细胞汇合度达到70%时，在5 μL的opti-MEMTM中加入0.1 μg重组质粒和0.2 μL P3000试剂，混匀后形成A液静置5 min。然后在5 μL的opti-MEMTM中加入1.5 μL LipofectamineTM3000和1 μL miRNA溶液，混匀后形成B液静置5 min，并将上述A和B 2种溶液混匀后静置15 min。将细胞培养基更换为DMEM，加入混合的溶液后，在培养箱中孵育6 h后更换为完全培养基继续培养。36 h后根据双荧光素酶试剂盒操作说明对转染的前体脂肪细胞荧光素酶活性进行检测。

1.2.5 猪前脂肪细胞诱导分化过程中miR-181a和miR-181d-5p及其靶基因与成脂分化相关基因的表达变化 当分离的前脂肪细胞密度达80%时，将完全培养液替换为诱导液(DMEM+10% FBS+1.7 μmol/L胰岛素+1 μmol/L地塞米松+0.5 μmol/L IBMX)；3 d后，将诱导液替换为维持液(DMEM+10% FBS+1.7 μmol/L胰岛素)；3 d后，维持液替换为完全培养液，以培养液更换诱导液日期为第0天，分别收取诱导0、2、4和6 d的脂肪细胞提取总RNA，通过实时荧光定量PCR方法检测miR-181a和miR-181d-5p及其靶基因的表达变化。参考NCBI和miRBase数据库中CREB1、GPD2、PPARγ、C/EBPα和GAPDH基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物信息见表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以GAPDH为内参，实时荧光定量PCR方法同1.2.2。

1.2.6 miR-181a和miR-181d-5p在脂肪细胞中的功能验证

1.2.6.1 miR-181a和miR-181d-5p转染脂肪细胞 将生长良好的脂肪细胞以1.5×105/cm2的密度接种到24孔板中，培养24 h，在细胞汇合达到80%时进行转染。转染分为miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics、miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor、miR-181a NC、miR-181d-5p NC、miR-181a siRNA、miR-181d-5p siRNA 8组，具体方法同1.2.4.3。诱导和转染6 d后提取细胞RNA进行实时荧光定量PCR，具体方法同1.2.2。

1.2.6.2 油红O染色诱导分化的脂肪细胞 使用PBS清洗分别转染mimics、inhibitor、siRNA以及空白对照组且已经诱导6 d的脂肪细胞，随后于室温下用4%多聚甲醛固定30 min。去掉多聚甲醛，PBS清洗3遍，每遍5 min，之后用油红O试剂室温下孵育细胞30min。然后去掉油红O试剂后用PBS清洗3遍，每遍5 min，最后每孔加入200 μL PBS将油红O着色后的细胞覆盖，于显微镜下观察拍照。

1.3 数据统计分析

用SPSS 22.0软件进行Student’s t-test分析，结果用平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 序列保守分析

通过比对各物种miRNA的种子序列，发现miR-181a与miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性(表2)。

2.2 miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中的表达量

由图1可知，miR-181a在背部皮下脂肪组织中的表达量极显著高于肌肉组织(P<0.01)；miR-181d-5p在背部皮下脂肪组织中的表达量显著高于肌肉组织(P<0.05)。

2.3 miR-181a和miR-181d-5p靶基因筛选

通过数据库共预测到381个miR-181a潜在靶基因和486个miR-181d-5p的潜在靶基因。对这些基因进行GO功能和KEGG通路注释发现，miR-181a和miR-181d-5p潜在靶基因主要涉及细胞生长发育、RNA聚合酶Ⅱ特异性、转录因子结合、蛋白质磷酸化以及脂质代谢等方面。共筛选出27个与成脂分化相关的靶基因，结合miRNA与靶基因的结合自由能分析结果，最终确定miR-181a的靶基因为结合自由能为-107.9 kJ/mol的甘油-3-磷酸脱氢酶2(GPD2)基因；miR-181d-5p的靶基因为结合自由能为-107.9 kJ/mol的 CAMP应答元件结合蛋白1(CREB1)基因(图2)。

2.4 miRNA与预测基因靶标关系验证

通过材料方法中的生物信息分析软件，预测miR-181a和miR-181d-5p与靶基因的结合位点(图3A)。双荧光素酶报告基因试验结果显示，共转染的miR-181a-WT+GPD2-WT野生型载体组的细胞中荧光素酶的活性极显著低于共转染的miR-181a-NC+GPD2-WT野生型载体(P<0.01)，共转染的miR-181d-5p-WT+CREB1-WT野生型载体组的细胞中荧光素酶的活性极显著低于共转染的miR-181d-5p-NC+CREB1-WT野生型载体(P<0.01)。将共转染miRNA-NC+Gene-MUT与共转染的miRNA-WT+Gene-MUT相比，前体脂肪细胞中的荧光素酶活性没有明显变化。因此，miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GDP2和CREB1基因3′-UTR区域序列，抑制GDP2和CREB1基因的表达(图3B)。

2.5 miR-181a和miR-181d-5p及其靶基因在猪脂肪细胞分化过程中的表达

由图4可知，与未分化脂肪细胞(0 d)相比，miR-181a在分化的第4天显著升高(P<0.05),到第6天达到极显著差异(P<0.01)；miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因在分化的第4、6天均极显著升高(P<0.01)(图4)。

表2 miRNA序列的保守性分析

*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)。图3同*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.3图1 miR-181a(A)和miR-181d-5p(B)在肌肉和脂肪组织中表达Fig.1 Expression of miR-181a (A) and miR-181d-5p (B) in muscle and adipose tissue

A，miR-181a预测靶基因功能富集图；B，miR-181d-5p预测靶基因功能富集图；C，miR-181a与靶基因GPD2结合自由能；D，miR-181d-5p与靶基因CREB1结合自由能A,Functional enrichment map of miR-181a prediction target gene;B,Functional enrichment map of miR-181d-5p predicting target gene;C,Binding free energy of miR-181a and target gene GPD2;D,Binding free energy of miR-181d-5p and target gene CREB1图2 miRNA与靶基因GO和KEGG分析及结合自由能预测结果Fig.2 Results of miRNA and target genes GO and KEGG analysis and binding free energy prediction

A，miRNA与靶基因3′-UTR序列比对结果；B、C，双荧光检测结果A,Sequence alignment result of miRNA and target gene 3′-UTR;B and C,Double fluorescence test results图3 miRNA靶基因验证结果Fig.3 miRNA target gene verification results

①A～D，分别为miR-181a、miR-181d-5p、GPD2和CREB1在脂肪细胞分化过程中的相对表达量。②与对照组(0 d/NC)相比，*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)。下同①A-D,The relative expression levels of miR-181a,miR-181d-5p,GPD2 and CREB1 during adipocyte differentiation,respectively.②Compared with the control group(0 d/NC),*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as below图4 miRNA及其靶基因在猪脂肪细胞分化过程中表达Fig.4 Expression of miRNAs and their target genes during porcine adipocyte differentiation

2.6 miR-181a与miR-181d-5p在脂肪细胞中功能验证

实时荧光定量PCR检测结果表明，与NC组相比，mimics组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著上升(P<0.01)，inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降(P<0.01)(图5A、6A)；mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降(P<0.01)，inhibitor组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升(P<0.01)(图5B、6B)，mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因表达量均显著或极显著上升(P<0.01)，inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因表达量均显著下降(P<0.05)(图5C、6C)。油红O染色结果表明，与NC组相比，mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加，inhibitor组细胞脂滴数目减少(图5D、6D)。

A，miR-181a在不同处理细胞中表达变化；B，GPD2基因在不同处理细胞中表达变化；C，成脂分化标志基因PPARγ和C/EBPα在不同处理细胞中表达变化；D，油红O染色结果(100×)A,miR-181a expression changes in different treated cells;B,GPD2 gene expression changes in different treated cells;C,Adipogenic differentiation marker genes PPARγ and C/EBPα expression changes in different treated cells;D,Oil red O staining result (100×)图5 miR-181a及其靶基因GPD2和成脂分化基因的表达Fig.5 Expression of miR-181a and its target gene GPD2 and adipogenic differentiation genes

A，miR-181d-5p在不同处理细胞中表达变化；B，CREB1基因在不同处理细胞中表达变化；C，脂肪分化标志基因PPARγ和C/EBPα在不同处理细胞中表达变化；D，油红O染色结果(100×)A,miR-181d-5p expression changes in different treated cells;B,CREB1 gene expression changes in different treated cells;C,adipose differentiation marker genes PPARγ and C/EBPα expression changes in different treated cells;D,Oil red O staining result (100×)图6 miR-181d-5p及其靶基因CREB1和成脂分化基因的表达Fig.6 Expression of miR-181d-5p and its target gene CREB1 and adipogenic differentiation genes

3 讨 论

在哺乳动物中，miRNA与自身种子序列匹配的靶基因3′-UTR区域结合后，通过转录抑制或降解靶基因的mRNA，从而发挥作用。miRNA对猪脂肪细胞的增殖和分化的调控已成为近年来的研究热点。已有研究表明，miRNA在前脂肪细胞的分化过程中扮演着重要作用[12]。miR-181a和miR-181d-5p属于miR-181家族，本研究通过序列比对分析发现，miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠物种间高度保守，是重要的miRNA。组织表达谱结果显示，miR-181a和miR-181d-5p在猪皮下脂肪组织中特异性高表达，且miR-181a和miR-181d-5p在猪脂肪细胞分化第4天开始大量表达，表明其在脂质生成过程中具有重要作用。 研究表明，miR-181a可通过靶向转录因子7样2(TCF7L2)和Smad家族成员7(Smad7)调节Wnt和TGF-β/Smad信号通路，促进3T3-L1前脂肪细胞脂肪生成和分化,并且miR-181a通过靶向C2C12成肌细胞胰岛素信号通路中的Akt3调节脂肪细胞分化[18]。Gao等[19]研究表明，miR-181d-5p是多个细胞过程中的抑制因子，通过CDKN3/Akt途径抑制非小细胞肺癌的进展。 本研究使用miR-181a和miR-181d-5p的mimics转染猪的前脂肪细胞，相较于阴性对照其靶基因GPD2和CREB1表达量下降，成脂分化标志基因PPARγ和C/EBPα表达量上升，与靶基因siRNA干扰组结果一致；而miR-181a和miR-181d-5p的inhibitor转染的脂肪细胞其靶基因GPD2和CREB1表达量上升，成脂分化标志基因PPARγ和C/EBPα表达量下降，与靶基因siRNA干扰组结果相反。转染miR-181a和miR-181d-5p mimics与转染靶基因siRNA组脂肪细胞脂滴数目均增加，而转染其inhibitor的脂肪细胞脂滴数目减少。综上所述，miR-181a和miR-181d-5p分别结合靶基因GPD2和CREB1 3′-UTR区域序列，降低靶基因表达量，促进脂肪细胞成脂分化。

GPD2基因可编码线粒体3-磷酸甘油脱氢酶(mGPD)，研究表明mGPD在产热中起作用[20]。mGPDH和3-磷酸甘油(G3P)酰基转移酶竞争相同的底物，并且由于其在脂肪组织中具有非常高的活性，mGPDH可以显著影响可用G3P的浓度，进而调控甘油三酯和磷脂的合成，最终对脂肪细胞的成脂分化产生影响[21]。Zhou等[22]研究指出,CREB1是一类细胞核内调控转录因子，通过调控C/EBPα、C/EBPβ及PPARs基因的表达，从而抑制脂肪细胞的分化。Cui等[23]研究发现，CREB1直接调控瘦素(LEP)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGCR)等与脂质代谢相关的基因的表达，表明CREB1在脂质代谢过程中起着重要的调节作用。本研究通过GO和KEGG功能注释发现，miR-181a的靶基因GPD2涉及生长发育、RNA聚合酶Ⅱ特异性以及蛋白质磷酸化等多个与脂质代谢功能相关，miR-181d-5p的靶基因CREB1涉及Wnt信号通路的调控、蛋白质磷酸化以及脂肪代谢等方面，所以可以通过抑制靶基因CREB1的翻译从而促进脂肪细胞的增殖和分化。通过转染miR-181a与miR-181d-5p的模拟物发现，脂肪细胞分化能力增强，脂肪标志基因PPARγ和C/EBPα表达量上升，与靶基因GPD2和CREB1的干扰结果相似，而转染miR-181a与miR-181d-5p的抑制物则可以抑制脂肪细胞的分化，脂肪标志基因PPARγ和C/EBPα表达量下降，说明GPD2和CREB1基因在受到miRNA靶向结合后表达水平下降，相关功能受到抑制，最终可以促进脂肪细胞的分化。

研究发现，一些miRNA可通过靶向调控重要的成脂分化相关基因，从而调控脂肪沉积。如在脂肪细胞3T3-L1中，miR-139-5p、miR-155、miR-301a和miR-302a可以靶向结合PPARγ基因，抑制脂肪细胞分化[9]；miR-185可显著降低成脂标志基因PPARγ、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、脂蛋白脂肪酶(LPL)等多个mRNAs的表达，从而负向调控3T3-L1细胞的分化[24]。对荣昌猪皮下脂肪进行miRNA的测序分析鉴定出多个保守miRNA参与猪脂肪生成[25]，如miR-125b-5p抑制皮下脂肪细胞增殖并促进分化；miR-17、miR-21和miR-143促进骨髓来源的间充质干细胞向脂肪细胞细胞分化；miR-125a通过靶向结合雌激素相关受体α(ERRa)抑制猪皮下脂肪细胞的增殖和分化；miR-375靶向结合BMPR2抑制猪皮下脂肪细胞的增殖和分化；miR-196a和miR-33b抑制猪皮下脂肪细胞分化等。本研究所揭示的miR-181a与miR-181d-5p在脂肪沉积中的功能仅属复杂调控过程中的一环，但是这些信息将为脂肪沉积发生和形成的分子机制解析提供重要线索。

4 结 论

本研究通过生物信息学的方法筛选出miR-181a的靶基因GPD2、miR-181d-5p的靶基因CREB1，miR-181a与miR-181d-5p在猪皮下脂肪组织中特异高表达，且在脂肪细胞分化过程中可以分别靶向结合基因GPD2与CREB1的3′-UTR区域序列，降低GPD2和CREB1基因的表达，促进脂肪细胞成脂分化。