一年继代1次的蚕种单式库外保护和单式冷藏试验

陶积阳 黄胜 安春梅 张雨丽 刘艳伟 陆俣伽 闭立辉

(1. 广西壮族自治区蚕业科学研究院， 南宁 530007； 2. 广西壮族自治区蚕业技术推广站， 南宁 530007)

广西蚕业科学研究院目前保存的约400份家蚕种质资源，其化性多为二化性或二化性含多化性血统，这些种质资源为家蚕遗传育种和品种改良提供了素材。家蚕种质资源的继代保存被认为是一项需要持续进行的基础性、公益性工作，因为蚕种的保存时间一般无法超过1年，不能像植物种质资源的种子那样长期保存，每年的家蚕种质资源继代保种饲养次数多、工作量大、操作细碎繁锁且技术性强。目前，我们对保存的大量二化性或二化性含多化性血统的家蚕种质资源的继代方法为春制秋繁和秋制春繁，一年继代2次，如果能探索出一年只继代1次的有效保种技术和方法，将大大节省人力、物力和财力。广东省蚕业技术推广中心自2005年以来利用复式冷藏对其保存的80多份二化性或二化性含多化性血统的家蚕种质资源实施一年继代1次的保种方法，每年都顺利完成了保种工作[1]，但保种方法的技术处理要求非常高，整个复式冷藏过程中的变温处理复杂且繁琐。因而，基于二化性和二化性含多化性血统家蚕种质资源实施一年继代1次的可行性，探索更为简单易行的蚕种保护与冷藏方法仍十分必要。

有关延长蚕种保存时间的方法前人已做了大量的研究。吴大洋等[2]的研究表明，利用25 ℃高温能促进蚕卵胚胎滞育，1 ℃低温可抑制胚发育维持滞育期，5 ℃能促进滞育解除，因而可将越年种在产卵后用25 ℃高温保护30～45 d，当滞育稳定后马上移入冷库1 ℃低温保存，使用前80～100 d，再将库温升到5 ℃，待滞育解除后即可出库催青。此方法也叫两段冷藏方法，能将越年种的有效保存时间延长到400 d以上，最长可达700 d，不过这仅限于特定的家蚕品种及试验条件。此外，延长蚕种的保存时间主要会影响孵化率，对幼虫的健康性及产茧量的影响并不显著，故滞育卵在1 ℃±0.5 ℃的温度条件下保存300～400 d是可行的，但产卵后必须经25 ℃保存80～100 d方可达到较好的实用效果[3]。冯家新[4]总结得出：25 ℃是完成蚕卵滞育最适温度，接触时间限于90 d以内，以60 d较为安全，如延长到100 d以上则会显著增加死卵率和降低孵化率；以25 ℃保护90 d以内，保护日数越长，解除滞育所需低温保护最长日数也越长，但超过90 d以上的更长日数保护，其解除滞育所需低温日数反而缩短，即25 ℃保护日数的界限在90 d左右。毛洪斌等[5]的研究发现随着冷藏时间延长，蚕种出库浸酸处理的实用孵化率、蚁蚕生命力有低于不浸酸处理的倾向。另有研究表明，秋制越年夏用种可以通过降低冷藏温度延期作早秋用种，以拓宽蚕种的冷藏期限，方便养蚕生产布局的调整[6]；采用单式冷藏法的越年种超过冷藏期限 120 d，可以使蚕种冷藏期限达到 190 d[7]。

目前对常规单式冷藏是否能超长期保存蚕种的研究还鲜有报道。本试验以广西蚕区大面积饲养的含多化性血统的二化性家蚕品种两广二号的一代杂交种供试，通过不同组合的库外保护时间和不同库内冷藏时间设置，寻求一种简单实用的超长期保存蚕种的方法，以便为进一步开展二化性及二化性含多化性血统的家蚕种质资源一年1次继代的试验提供技术参数，同时也为大面积生产上两广二号延期用种进行单式库外保护和单式冷藏提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试家蚕品种

以广西蚕业技术推广站家蚕育种研究室生产的两广二号正交和反交蚕种供试，产卵日期为2019年11月12日。两广二号是含多化性血统的二化性夏秋用四元杂交组合(932·芙蓉×7532·湘晖)。

1.2 试验时间和地点

试验时间为2019年11月12日—2020年10月14日，试验地点为广西蚕业技术推广站家蚕育种研究室保护室、蚕种管理科2号冷库。

1.3 试验方法

试验设9个处理组，每个处理组正交和反交蚕种各12个蛾圈，每个处理设3组重复。

1.3.1 蚕种库外越夏保护环境和时间

供试家蚕品种产卵后，置蚕种于温度25 ℃、相对湿度75%的越夏保护室，室内温湿度全自动化控制；保护期分别设置为10 d、40 d、70 d、100 d、130 d、160 d、190 d、220 d和250 d。产卵后10 d进行常温2%甲醛溶液浴消20 min，漂洗晾干。

1.3.2 蚕种库内冷藏环境和时间

冷库温度3.5 ℃，相对湿度95%；冷藏时间分别设置为 310 d、280 d、250 d、220 d、190 d、160 d、130 d、100 d和70 d。为了增加不利环境因素对蚕种的冲击，采用无中库过渡处理，即直接将蚕种从保护室转移到内库冷藏。

1.3.3 入库前的孵化率调查

入库前对供试蚕种逐圈作孵化调查，用黑色水性笔点白卵壳记数。

1.3.4 出库和催青处理

9个处理组的蚕种出库时间同在2020年9月28日，试验蚕种从内库取出置于自然温度下2 h后，浸泡在2%甲醛溶液30 min卵面消毒(不浸酸)，漂洗后置于保护室晾干并开始催青，催青温度27～28 ℃，相对湿度75%～80%。蚕种见点青后，逐日观察记录蚕种点青、转青、孵化的情况，直至蚕卵不再孵化出蚁，再用80 ℃以上热水浸泡蚕种5 min后晾干待调查。

1.3.5 孵化率调查方法

对9个处理组的正交和反交蚕种出库催青后的孵化率进行逐圈调查。由于有些处理区中的蚕卵孵化很不整齐，无法采用二日实用孵化率进行调查，故对孵化期内的孵化率进行调查统计。

2 结果与分析

2.1 蚕种库外保护时间和冷藏时间对几项指标的影响

供试蚕种库外保护时间及入库冷藏时间对入库前孵化率、催青期日数、孵化日数、孵化整齐度影响的调查数据见表1。

2.1.1 入库前的孵化率

正交种库外保护10～220 d的蚕种在入库前无孵化，库外保护250 d的蚕种入库前有少量孵化，但孵化率仅为0.83%；反交种库外保护10～190 d的蚕种，入库前无孵化，库外保护220 d的蚕种入库前有少量孵化，孵化率也仅为0.83%，库外保护250 d的蚕种入库前有较多孵化，孵化率为4.17%。说明库外保护时间超过某个极限值时，虽然没有接触低温，但越年卵也会陆续孵化，并有随着库外保护时间的延长而逐渐增多的倾向。

2.1.2 催青期经过时间

催青期经过时间为从出库当天到第1天出蚁的时间。正交种催青期经过的时间除处理组1外，均随着库外保护天数的增加而增加，随着库内冷藏天数缩短而延长，为8～10 d；反交种催青期经过的时间亦是除处理组1外，随着库外保护天数的增加而增加，均随着库内冷藏天数缩短而延长，为8～9 d，比正交种稍短。

2.1.3 蚕卵孵化经过时间和盛孵化天数

正交种和反交种孵化经过时间和盛孵化天数均随库外保护天数增加而增加，随库内冷藏天数减少而增加，孵化经过2～7 d，正交种盛孵化2～5 d，反交种盛孵化2～6 d。根据生产上二日盛孵期的孵化率为实用孵化率，且应≥90%，那么正交种库外保护时间≥160 d和反交种库外保护时间≥220 d不浸酸催青，其孵化整齐度无法达到标准要求。

2.1.4 蚕卵孵化的整齐度

当库外保护时间为40～130 d，正交种和反交种的孵化均整齐；库外保护时间为160～190 d，反交种的孵化较整齐，正交种的孵化不整齐；库外保护时间为220 ～250 d，正交种和反交种孵化均很不整齐。

表1 两广二号蚕种不同库外保护时间与库内冷藏时间对各项指标影响的调查数据

2.2 蚕种库外保护时间和冷藏时间对孵化率的影响

供试蚕种库外保护时间及入库冷藏时间对蚕卵孵化率影响的调查数据见表2。

2.2.1 正交种的孵化率

处理组1库外保护时间只有10 d的情况下，蚕卵催青后的平均孵化率最低，只有43.20%；处理组8和处理组9在库外的保护时间分别为220 d、250 d，蚕卵催青后的平均孵化率也分别只有84.22%和65.11%。以上3个处理组平均孵化率均<90%，其余处理组的蚕卵平均孵化率均>90%。平均孵化率最高的为处理组5，即蚕种库外保护130 d、库内冷藏190 d，其平均孵化率达到98.31%。

2.2.2 反交种的孵化率

处理组1库外保护10 d，蚕卵催青后的平均孵化率最低，只有2.52%；处理组2在库外保护40 d的情况下，平均孵化率也只有68.09%。其余处理组平均孵化率>90%，均能达到较高的孵化率，平均孵化率最高的为处理组4，其库外保护时间为100 d、库内冷藏时间为220 d，平均孵化率达到94.73%。

表2 两广二号蚕种不同库外保护时间与库内冷藏时间对孵化率影响的调查数据

3 讨论

3.1 蚕种的库外保护时间和冷藏时间对孵化率影响大

供试蚕种在库外保护10 d的处理组，无论正交种还是反交种的孵化率都最低。这一结果说明库外保护时间过短，蚕卵胚胎还没较好地进入休眠状态，不具备耐受长时间低温冷藏的能力。供试蚕种在库外的保护时间达40 d，蚕卵胚胎基本上进入休眠状态，蚕种耐冷藏的能力有了大幅度提升。当供试蚕种在库外的保护时间达70 d，蚕卵胚胎已进入深度的休眠状态，蚕种耐冷藏的能力达到一个较高而且较稳定的峰值。当供试蚕种在库外保护时间≥220 d，冷藏时间≤100 d时，正交种的孵化率明显快速下降，孵化愈发不整齐，主要原因应该是库内冷藏时间太短，不足以使蚕种解除滞育，其次是因为蚕种库外保护时间太长，受不利环境因素影响越大，消耗蚕卵内过多的营养。当库外保护时间≥70 d并≤190 d，同时冷藏时间≥130 d并≤250 d时，即在库外保护时间+冷藏时间之和不超过320 d时，其平均孵化率均≥92%，主要原因是库外保护时间已足够让蚕卵进入深度休眠，大于120 d的冷藏时间又足够使大多数蚕卵能解除滞育。因此，蚕种的超长期保护和冷藏，需要足够的库外保护时间和适当的冷藏时间，这也是技术处理的关键。

3.2 同等条件处理正交种和反交种的孵化率存在较大差异

处理组1的供试蚕种在库外的保护时间为10 d，正交种平均孵化率有43.20%，而反交种的平均孵化率只有2.52%；处理组2的供试蚕种在库外保护的时间为40 d，其正交种的平均孵化率达97.10%，而反交种的平均孵化率只有68.09%。这说明在库外保护阶段，正交种进入耐冷藏阶段的速度比反交种快了近1倍，正交种进入耐冷藏阶段需要约40 d，而反交种进入耐冷藏阶段需要约70 d。

处理组8在库内冷藏时间为100 d，正交种的平均孵化率只有84.22%，而反交种的平均孵化率可达91.59%；处理组9在库内冷藏时间为70 d，正交种的平均孵化率只有65.11%，而反交种的平均孵化率仍能有90.34%。这说明正交种解除滞育需要更长的冷藏时间，当冷藏时间≥130 d，平均孵化率才能达到90%以上；而反交种解除滞育所需冷藏时间相比正交种差不多缩短了一半，冷藏时间只需要≥70 d，其平均孵化率就能达到90%以上。需要说明的是，这是在库外保护250 d的情况下得到的结果，如果存在不同的库外保护时间，正、反交种各自需冷藏多久才能解除滞育，则还需要进一步试验研究。

3.3 两广二号在生产上延期用种的可行性

供试的两广二号在蚕种生产上通常即浸种出库适期的跨度为≤30 d，冷藏种出库适期跨度为≤220 d[7]。如果两广二号的蚕种能在市场低迷时参考本次试验的参数，把传统的库外最长保护时间30 d延长至≥70 d，库内冷藏时间设定为130～250 d，即库外保护时间和库内冷藏时间之和控制在≤320 d，孵化率均能达到92%以上，将能大大增加两广二号的出库适期跨度，即跨度为≤320 d，这样就能根据需要改变出库日期，避开蚕种市场低迷期出库以减小损失。当然，增加两广二号的出库适期跨度的生产应用，还需要进行饲育试验对孵化蚁蚕的体质、健康性、抗逆能力等指标的调查分析，才能确定其可行性。

4 小结

供试的两广二号正交种经库外保护40～190 d 再入库冷藏后的平均孵化率均在92%以上，反交种经库外保护70～250 d再入库冷藏后的平均孵化率均在90%以上，都达到农业部桑蚕一代杂交种越年种孵化率≥90%的标准要求[8]。其中，库外保护70～130 d，冷藏190～250 d的蚕种出库后不浸酸也能达到孵化整齐的要求；库外保护160～190 d，冷藏130～160 d的蚕种出库后不浸酸则孵化不够整齐。本试验中，两广二号正交种库外保护10 d、220 d、250 d后再冷藏，其孵化率分别为43.20%、84.22%、65.11%；反交种库外保护10 d、40 d后进行冷藏，其孵化率分别为2.52%和 68.09%。以上处理的蚕种均低于农业部桑蚕一代杂交种越年种孵化率≥90%的标准要求。

基于本试验结果，初步认为广西现有的二化性或二化性含多化性血统的家蚕种质资源可以进行单式库外保护和单式冷藏一年1次继代保种的试验。蚕种各阶段保护时间及保护条件设计如下：产卵后库外保护时间以不少于70 d但又不超过190 d为宜(即库外保护时间控制在70～190 d)，控制库外保护室的环境温度为24～25 ℃、相对湿度为 75%～80%，并在产卵后10～20 d进行蚕种浴消防止霉变，入库前经5～20 d的中库温度(10～13 ℃)过渡后，转入温度2.5～5.0 ℃、相对湿度75%～85%的冷库中冷藏130～250 d为宜，库外保护时间加库内冷藏时间之和控制在320 d左右。同时需要注意的是，蚕种库外保护160～190 d，冷藏时间在160～130 d的处理，出库时如果不进行浸酸处理，则孵化可能欠整齐，故需要通过出库浸酸测试以达到孵化整齐的目的。

广西保存的约400份家种质资源多数为二化性或二化含多化性血统，不同种质资源的遗传性状及抗性必然存在差异，单式库外保护和单式冷藏处理具体适用于哪些种质资源一年继代1次保种，还需进行深入的研究。