尼罗罗非鱼E-钙黏着蛋白的基因克隆及组织表达分析

杨惠源，陈泓霖，李瑞雪，杨志会，吴颖瑞，吴信忠，蔡小辉

( 1.北部湾大学 海洋学院，广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室，广西 钦州 536011；2.广西大学 生命科学与技术学院，广西 南宁 530004； 3.邢台市农业农村局，河北 邢台 054000 )

尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)，又称非洲鲫鱼，属鲈形目、丽鱼科、罗非鱼属。尼罗罗非鱼因繁殖迅速、生长快、肉质细嫩、蛋白质含量丰富、适应性强、经济效益高等优点，深受渔业养殖户的青睐。近年来，我国海南、广东和广西等南方地区的罗非鱼无乳链球菌病情况严重，发病死亡率高达95%[1-3]，不仅对罗非鱼的养殖产业造成了严重打击，同时也让罗非鱼一直以来具有抗病力强、不易患病的观点遭到质疑。有研究报道，链球菌病暴发时间段主要为每年的3—11月，其中5月和9月为发病高峰期，影响发病的因素主要有环境因素和生物因素，其中环境因素表现为养殖区域周围的环境问题和水质污染问题等，其传播途径为鱼体间接触传播和水体以及饲料间接传播[4-5]。

无乳链球菌 (Streptococcusagalatiae) 又称B族溶血性链球菌(GBS)，外层由荚膜包被着，无乳链球菌可通过荚膜的相变来逃避宿主免疫[6]。研究证实，无乳链球菌可通过胃肠道上皮侵入罗非鱼体内从而引起各种病状[7]。但有关无乳链球菌是通过何种机制侵入罗非鱼肠道上皮的研究尚未见报道。E-钙黏着蛋白(E-cadherin)是定位在细胞表面的跨膜糖蛋白，主要存在上皮组织中，可作为受体与单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的内化素(InlA)[8]和肺炎链球菌(S.pneumoniae)表面蛋白(PspA)[9]相连接，细菌可依靠这种连接侵入宿主细胞。目前尚未见关于尼罗罗非鱼E-钙黏着蛋白(On-ECdh)功能的相关报道。笔者对尼罗罗非鱼On-ECdh基因(GenBank登录号：MT370500)进行克隆，分析该基因编码的氨基酸序列，研究无乳链球菌刺激前后On-ECdh基因在尼罗罗非鱼体内的表达模式，以期为罗非鱼E-钙黏着蛋白的功能研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

健康尼罗罗非鱼300尾购自广西钦州市某罗非鱼养殖场，体质量约50 g。RNA提取试剂(Trizol、氯仿、无水乙醇、75%乙醇和无RNA酶水)、反转录cDNA合成试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。无乳链球菌菌种由本实验室保种。pMD18-T载体和Taq DNA聚合酶购自日本TaKaRa公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 尼罗罗非鱼总RNA提取和第一链cDNA合成

健康尼罗罗非鱼暂养于室内养殖系统[(28±2) ℃]。随机剖取3尾健康尼罗罗非鱼的脑、鳃、眼、头肾、心脏、胃、肠道、肝脏、脾脏和肌肉10个组织，分别放入装有500 μL Trizol的2.0 mL无RNA酶离心管中，按照TransZol Up说明书提取组织RNA。按cDNA合成说明书将总RNA反转录成第一链cDNA，保存至-80 ℃备用。

1.2.2 On-ECdh基因引物设计

根据NCBI数据中罗非鱼全基因组数据(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_0319 65.2)，设计合成罗非鱼On-ECdh基因克隆引物E-cadherinF/E-cadherinR(表1)。运用Premier 5.0软件设计荧光定量引物RT-cadherinF/RT-cadherinR和荧光定量分析内参β-actinF/β-actinR引物(表1)。

表1 试验所用引物

1.2.3 On-ECdh基因片段扩增

以尼罗罗非鱼的cDNA为模板，利用引物E-cadherinF/E-cadherinR对On-ECdh基因序列进行扩增。扩增体系为：cDNA 2 μL、引物E-cadherinF/E-cadherinR各2 μL、Premix Taq 25 μL、H2O 19 μL。反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，33个循环；72 ℃ 10 min；16 ℃保存。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，并回收纯化PCR产物。将切胶回收后目的DNA片段与pMD18-T 载体连接，转化到DH5α感受态细胞。将菌落PCR鉴定为阳性的菌落送至赛默飞世尔科技(中国)有限公司广州分公司进行测序验证。

1.2.4 On-ECdh基因生物信息学分析

根据所测得的序列用DNAMAN软件拼接获得On-ECdh基因全长序列，并用下列方法进行生物信息学分析：通过Ex PASy Proteomics Server在线软件(http://web.expasy.org/protparam/)进行蛋白质理论等电点预测、分子量和亲水性等信息的推测；蛋白质的跨膜结构域预测利用TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列比对分析；使用SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽序列预测；SoftBerry-Psite分析氨基酸基本功能位点分布预测；采用NCBI Conserved Domains (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白保守结构域；利用SWISSM-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模分析。结合ClustalX和GeneDoc软件，对氨基酸序列进行多重比对分析；利用MEGA 7.0软件构建系统进化树。

1.2.5 无乳链球菌刺激后On-ECdh基因组织分布情况

将暂养在室内养殖系统的健康尼罗罗非鱼(50 g)先饥饿 2 d，随机挑选80尾进行试验，方法如下：将过夜培养的无乳链球菌稀释至1×107cfu/mL，使用口腔灌胃方法[10]将上述稀释细菌按照0.1 mL/尾，灌入80尾尼罗罗非鱼。分别在攻毒后1、3、6、12、24、48、72、96 h各时间段，取6尾剖取鳃、眼、头肾、胃、肠、脾脏和肝脏6个组织。立即放入装有1.5 mL RNAlater的无RNA酶离心管中，-80 ℃保存。另取10尾尼罗罗非鱼每尾注射生理盐水0.1 mL作为0 h的空白对照组。

荧光定量PCR所用RNA提取和cDNA合成步骤同1.2.1。将合成的第一链cDNA稀释10倍cDNA作为模板，以β-actin 基因作为内参基因，参照Transgen Biotech公司的TransScript®Green qPCR SuperMix试剂盒说明书，使用实时荧光定量PCR仪(QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System，购自Life Technologies)检测On-ECdh基因在各组织中的表达表达水平，每个反应重复3次。反应体系为10 μL：cDNA 0.5 μL、2×TransScript®Green qPCR SuperMix 5 μL、Passive Reference Day 0.2 μL、RT-cadherinF/RT-cadherinR各 0.4 μL。反应条件为：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环；95 ℃ 5 s，70 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反应结束后用QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System软件进行检测，选用3个重复熔解曲线相似单峰的Ct值。采用2-△△Ct法分析无乳链球菌刺激后各时间段各个组织的相对表达量情况，将计算结果使用 IBM SPSS Statistics 22 软件进行统计学单因素方差分析，分析其显著性水平(P<0.05表示差异显著)。

2 结 果

2.1 On-ECdh基因克隆和序列分析

On-ECdh基因全长2442 bp(GenBank登录号：MT370500)，编码813个氨基酸。Ex PASy Proteomics Server分析On-ECdh基因推导氨基酸理论分子质量为89.9 ku，等电点为4.81，其中含量最高的氨基酸为亮氨酸(9.3%)，其次为缬氨酸(9.1%)，带负电荷的氨基酸有119个，带正电荷的氨基酸有82个，预测为亲水性蛋白，平均亲水值为-0.303。SignalP-5.0 Server预测该序列1～26为信号肽区域，信号肽剪切位点在第26～27氨基酸之间(图1a)。TMHMM Server 2.0预测分析跨膜结构在第756～778个氨基酸(图1b)。运用Softberry线上预测On-ECdh氨基酸的功能位点得到以下信息：N-天冬酰胺糖基化(ASN_GLYCOSYLATION)位点1个；磷酸化环腺苷酸(CAMP_PHOSPHO_SITE)位点3个；蛋白激酶C磷酸化(PKC_PHOSPHO_SITE)位点有12个；蛋白激酶Ⅱ磷酸化(CK2_PHOSPHO_SITE)位点11个；酪氨酸激酶磷酸化(TYR_PHOSPHO_SITE)位点1个；酰基化(MYRISTYL)位点13个；酰胺化位点1个；异戊二烯基结合位点2个；微体C末端目标信号(MICROBODIES_CTER)11个。运用美国国立生物技术信息中心网站预测保守结构域，On-ECdh蛋白含有1个钙黏着蛋白前结构域、4个钙黏着蛋白重复样结构域、1个钙黏着蛋白细胞质结构域和1个跨膜结构域。

图1 尼罗罗非鱼On-ECdh基因序列及其推导的氨基酸序列(a)和蛋白保守结构区域(b)

2.2 尼罗罗非鱼On-ECdh同源比对及进化分析

通过与美国国立生物技术信息中心数据库中的其他物种的E-钙黏着蛋白氨基酸序列进行比对，结果发现尼罗罗非鱼与伯氏朴丽鱼(Haplochromisburtoni)的E-钙黏着蛋白氨基酸序列相似性最高，为79.04%，与已发现人(Homosapiens)、花斑剑尾鱼(Xiphophorusmaculatus)、斑马鱼(Daniorerio)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、家牛(Bostaurus)、家马(Equuscaballus)的相似性分别44.62%、52.59%、42.44%、37.12%、37.94%、43.70%(图2)。用ClustalX 2.0和MEGA 7.0软件的邻接法构建系统进化树，结果显示，尼罗罗非鱼和伯氏朴丽鱼的亲缘关系最为相近，在同一个分支，与其他物种亲缘关系较远(图3)。

图2 On-ECdh与其他物种E-钙黏着蛋白的氨基酸序列比对

图3 邻接法构建E-钙黏着蛋白基因系统进化树

2.3 On-ECdh基因组织表达分析

荧光定量PCR检测结果见图4。On-ECdh基因在健康的尼罗罗非鱼各组织均有分布，其中肝脏组织的表达最高，其次为鳃、肠道、胃、眼、肌肉、脾脏、脑、心脏，头肾的表达水平最低。

图4 On-ECdh基因在尼罗罗非鱼不同组织中的表达情况

2.4 无乳链球菌感染后On-ECdh基因组织表达分析

荧光定量PCR检测头肾、眼、胃、鳃、肠道和肝脏组织在无乳链球菌肠道感染后0、1、3、6、12、24、48、72、96 h的On-ECdh基因的表达模式结果见图5。结果发现，无乳链球菌感染后不同时间、不同组织中的表达量有很大差异。眼、头肾和肠道组织中的表达量呈上调表达，其中头肾中的表达量在刺激后1 h有所下降，在3 h时上升达到高峰。眼组织中的表达量在刺激1 h时即达到高峰，肠道中的表达量则在12 h时达到高峰。胃、鳃和肝脏组织中的表达量则呈下调表达。鳃中的表达量呈波浪型的趋势，在24 h时最低。胃与鳃中的表达量呈现相似的趋势，刺激1 h时最低。肝脏中的表达量则在刺激后则呈持续下调趋势。

图5 无乳链球菌刺激后各组织的On-ECdh基因表达时序变化

3 讨 论

3.1 On-ECdh基因序列特征和系统进化

本研究中，克隆了On-ECdh基因序列，该基因全长为2442 bp，编码813个氨基酸，具有1个钙黏着蛋白前结构域，4个钙黏着蛋白重复样结构域、1个钙黏着蛋白细胞质结构域和1个跨膜结构域。已有研究表明，钙黏着蛋白是一种以平行二聚体存在的跨膜蛋白，由5个钙黏着蛋白重复序列组成的钙黏着蛋白样结构区域的细胞外段可介导细胞与细胞间接触，发挥细胞信息传导、增殖或分化的作用[11-12]，钙黏着蛋白前结构域包含1个结合位点，是特异性的同种黏附所必需的，其余4个钙黏着蛋白重复序列在黏着结合中的作用尚不清楚。On-ECdh氨基酸的功能位点预测发现，其4个钙黏着蛋白重复样结构域上有糖基化位点1个、蛋白激酶C磷酸化位点6个、酪氨酸激酶磷酸化位点1个、磷酸化环腺苷酸位点1个等，表明其在细胞与细胞间结合和信号传导的过程中起到重要作用。研究显示，人源E-钙黏着蛋白的糖基化可直接影响细胞侵袭、增殖能力[13]；蛋白激酶C磷酸化通过直接或间接作用于E-钙黏着蛋白，在小鼠发育胚胎细胞压实起始过程中起作用[14]；在Caco-2细胞单层中用氧化应激诱导，可导致E-钙黏着蛋白和β-连环蛋白酪氨酸磷酸化的快速增加，引发细胞再分布和通透性增加[15]，说明酪氨酸磷酸化可能有调节细胞—细胞黏附的作用。另有研究显示，幽门螺杆菌(Helicobacterpylori) CagA蛋白通过酪氨酸磷酸化独立的方式可以与E-钙黏着蛋白相互作用，形成CagA-E-钙黏着蛋白复合物[16]；烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)能与E-钙黏着蛋白结合，并将其用作上皮细胞内胚孔黏附和内吞的受体[17]；E-钙黏着蛋白还可作为受体与单核细胞增生李斯特氏菌的内化素[8]和肺炎链球菌表面蛋白[9]相连接，介导细菌侵入宿主细胞。

通过多序列比对，发现On-ECdh与伯氏朴丽鱼E-钙黏着蛋白氨基酸序列的同源性为79.04%。构建系统发育树发现，尼罗罗非鱼On-ECdh基因和伯氏朴丽鱼E-钙黏着蛋白基因位于同一分支，与其他物种在不同分支，说明尼罗罗非鱼与伯氏朴丽鱼亲缘关系较近，与其他物种的亲缘关系较远。由此推测，On-ECdh保守结构域在进化过程中具有较高的保守性，并且不同物种有不同的差异性。

3.2 尼罗罗非鱼On-ECdh基因在无乳链球菌感染前后的表达模式

荧光定量检测发现，On-ECdh基因在健康尼罗罗非鱼肝脏、鳃、肠道、胃组织中均有较高表达量，在头肾组织中表达量最低。On-ECdh基因在各组织中表达量的差异主要是受尼罗罗非鱼体内上皮组织的分布和机体分泌的影响。无乳链球菌刺激后，On-ECdh基因在尼罗罗非鱼肝脏、鳃、胃组织的表达量下调，这可能跟无乳链球菌能够通过消化道进入罗非鱼机体内的血液循环并破环组织器官的感染路径[18]有关。值得注意的是，On-ECdh基因在眼、头肾、肠道组织中分别在感染1、3、12 h时表达量达到高峰，随后表达量显著下降。有研究表明，E-钙黏着蛋白在人上皮细胞间连接形成黏膜屏障的结构黏附力，可以参与气道上皮细胞机体免疫反应[19]；免疫细胞化学显示，E-钙黏着蛋白对腺癌细胞的敏感性为80.0%[20]。由此推测，尼罗罗非鱼机体受到无乳链球菌刺激后On-ECdh可能参与免疫反应。无乳链球菌刺激后On-ECdh基因在尼罗罗非鱼机体表达的结果与食管鳞癌患者大部分处于pTNM低期时E-钙黏着蛋白高表达而在食管鳞癌发生侵袭、转移时E-钙黏着蛋白处于低表达的结果[21]相似。此外，其他研究证明，在胃癌、大肠癌、肝癌细胞中E-钙黏着蛋白的表达量低于正常组织[22-24]。头肾是罗非鱼机体内主要的免疫器官，感染3 h时表达量上升，或许与罗非鱼机体的自身免疫反应调节有关。

4 结 论

笔者克隆了On-ECdh基因序列，该基因全长2442 bp，编码813个氨基酸，具有1个钙黏着蛋白前结构域、4个钙黏着蛋白重复样结构域、1个钙黏着蛋白细胞质结构域和1个跨膜结构域。通过多序列比对和构建系统发育树发现，On-ECdh基因与伯氏朴丽鱼E-钙黏着蛋白基因的同源性最高，达79.04%，并且位于同一分支。荧光定量检测发现， On-ECdh基因在健康的尼罗罗非鱼各组织中均有分布，其中肝组织中的表达量最高，无乳链球菌刺激后表达模式发生改变。该研究结果可为尼罗罗非鱼E-钙黏着蛋白基因功能研究提供基础资料。