结核感染T细胞斑点试验在脊柱结核辅助诊断中的应用价值

吴大鹏，韩博闻，万 广，赵恩典，谢会彬，宋 凯，梁秋冬

(新乡医学院第一附属医院骨科，河南 卫辉 453100)

骨与关节结核是常见的肺外结核病，脊柱结核则是骨关节结核最常见的类型，其发病隐匿，病情进展缓慢，临床表现缺乏特异性，容易误诊和漏诊，患者常因错过最佳治疗时机而导致病情延误[1-3]。脊柱结核可以引起椎体骨质塌陷、脊柱后凸畸形等，导致病理性骨折，病情严重的患者可因神经受到压迫而发生瘫痪，致残率较高[4]。传统的结核分枝杆菌培养、结核菌素试验、血清结核抗体检测和结核分枝杆菌DNA检测等对脊柱结核的检出率较低，且病理学检查的实施具有一定的局限性，这些因素严重影响了脊柱结核患者的早期诊断和治疗，导致患者预后较差[5]。因此，寻找更加有效、易操作的脊柱结核诊断办法成为提高脊柱结核早期检出率和患者预后的关键。结核感染T细胞斑点(T cell spot test for tuberculosis infection,T-SPOT.TB)试验是诊断肺外结核病的新手段，其基于免疫反应原理，采用酶联免疫吸附法检测外周血中特异性效应T细胞，在结核性胸膜炎、皮肤结核、骨结核等肺外结核病的诊断中显示出了良好的敏感性和特异性[6-9]。本研究旨在比较T-SPOT.TB试验、结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)、结核抗体试验、病理学检查对脊柱结核的诊断效果，以期寻求一种更好地诊断脊柱结核的方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年5月至2020年3月新乡医学院第一附属医院骨外科收治的经影像学检查疑似脊柱结核病患者106例，所有患者接受TST抗结核抗体试验、病理学检查和T-SPOT.TB试验，以临床综合诊断为金标准，最终确诊为脊柱结核69例(脊柱结核组)和非脊柱结核37例(非脊柱结核组)。脊柱结核组：男38例，女31例；年龄27～62(41.71±8.82)岁。非脊柱结核组：男20例，女17例；年龄23～60(40.81±9.42)岁。本研究方案经医院伦理委员会审核批准。

1.2 脊柱结核临床综合诊断标准符合下列任意2条即可诊断为脊柱结核[10]：(1)症状体征与影像学(包括X线、CT、磁共振成像检查等)发现的局部结核病灶的脓肿、死骨表现相符；(2)病灶标本的病理学检查提示为干酪样坏死并朗格汉斯肉芽肿；(3)病灶标本的微生物学检查(传统罗氏培养)证实为结核分枝杆菌感染；(4)规律抗结核药物治疗6个月以上，结核中毒症状及局部症状消失。

1.3 病例纳入和排除标准病例纳入标准：(1)临床诊断明确；(2)临床资料完整；(3)患者诊疗过程中配合良好；(4)患者自愿参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：(1)伴有自身免疫病引起的脊柱炎；(2)伴有其他部位或器官感染性疾病。

1.4 试验方法

1.4.1 TST采用纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)皮肤试验：吸取PPD 0.1 mL(5 U)，采用曼图法注射于受试者掌侧前臂皮内，注射后72 h 检查注射局部皮肤反应，测量皮肤硬结的直径。PPD皮肤试验阳性的判断标准：无反应或硬节直径<5 mm为阴性(-)，硬结直径≥5 mm为阳性(+)，其中5 mm≤硬结直径<15 mm记为TST5，硬结直径≥15 mm记为TST15。

1.4.2 结核抗体试验患者入院当日或次日晨使用抗结核药物之前使用一次性无菌肝素钠采血管采集空腹状态下外周静脉血5 mL后于当天送检验科，采用结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒检测血清抗结核抗体，试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书操作。结核分枝杆菌蛋白芯片以微孔滤过膜为载体，利用微阵列技术将3种已知的结核杆菌特异性抗原包被在同一检测膜片上，加入待测血清标本，经过微孔滤膜渗滤、凝集以及浓缩一系列作用，然后在膜片上进行抗原-抗体反应，最后将胶体金作为显色剂在膜上显色，3种抗原检测位点中任一检测位点显色即为该抗体阳性(+)，否则为阴性(-)。

1.4.3 T-SPOT.TB试验于患者入院当日或次日晨使用抗结核药物之前使用一次性无菌肝素钠采血管采集空腹状态下外周静脉血5 mL后于当天送检验科，采用T-SPOT.TB试剂盒进行试验，试剂盒购自英国Oxford Immunotec公司，严格按照试剂盒说明书操作。对每个标本设4个孔，分别加入结核杆菌特异性抗原A与B以及阳性对照抗原、阴性对照抗原，接种于包被有γ干扰素单抗的96孔板内，每孔加入50 μL，然后加入处理好的标本悬液100 μL，置于保温箱内培养，然后加入二抗与显色剂，使用ELISPOT斑点分析仪(德国AID公司)计数斑点形成细胞(spot forming cells,SFCs)，每个斑点代表1个活化的特异性T淋巴细胞。如果空白孔斑点数<6，则实验孔减去空白孔后斑点数≥6为阳性(+)，小于6为阴性(-)；如果空白孔斑点数≥6，则任一实验孔大于空白对照孔2倍斑点数为阳性(+)，小于、等于2倍为阴性(-)。

1.4.4 病理学检查取病灶中心区域组织标本，石蜡包埋、切片、抗酸染色，光学显微镜下观察。显微镜下观察到干酪样坏死、朗格汉斯细胞、 结核性肉芽肿等特征性表现中的1种及以上即判定为脊柱结核阳性(+)，未发现上述特征性表现者判定为阴性(-)。

1.5 统计学处理应用SPSS 15.0软件进行数据统计与分析。敏感度=结核组诊断结果阳性例数/结核组总例数×100%；特异度=非结核组诊断结果阴性例数/非结核组总例数×100%；阳性预测值=结核组诊断结果阳性例数/诊断结果阳性总例数×100%；阴性预测值=非结核组诊断结果阴性例数/诊断结果阴性总例数×100%。计数资料以例数和百分率表示，2组间比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。不同方法的一致性检验采用Kappa分析，Kappa值为0.00～0.20表示极低的一致性，0.21～0.40表示一般的一致性，0.41～0.60表示中等的一致性，0.61～0.80表示高度的一致性，0.81～1.00表示几乎完全一致性。

2 结果

2.1 T-SPOT.TB试验与TST5、TST15、结核抗体试验和病理学检查对脊柱结核的诊断价值比较结果见表1和表2。TST5、TST15、结核抗体试验、病理学检查和T-SPOT.TB试验诊断脊柱结核的敏感度分别为63.77%(44/69)、52.17%(36/69)、57.97%(40/69)、86.95%(60/69)、88.41%(61/69)，特异度分别为67.57%(25/37)、86.49%(32/37)、81.08%(30/37)、89.19%(33/37)、89.19%(33/37)，阳性预测值分别为78.57%(44/56)、87.80%(36/41)、85.11%(40/47)、93.75%(60/64)、93.85%(61/65)，阴性预测值分别为50.00%(25/50)、49.23%(32/65)、50.85%(30/59)、78.57%(33/42)、80.49%(33/41)。T-SPOT.TB试验诊断脊柱结核的敏感度显著高于TST5、TST15和结核抗体试验，差异有统计学意义(χ2=11.510、21.687、16.285，P<0.05)；T-SPOT.TB试验与病理学检查诊断脊柱结核的敏感度比较差异无统计学意义(χ2=0.067，P>0.05)。T-SPOT.TB试验诊断脊柱结核的特异度显著高于TST5，差异有统计学意义(χ2=5.103，P<0.05)；T-SPOT.TB试验与TST15、结核抗体试验和病理学检查诊断脊柱结核的特异度比较差异无统计学意义(χ2=0.126、0.961、0.001，P>0.05)。T-SPOT.TB试验诊断脊柱结核的阳性预测值显著高于TST5，差异有统计学意义(χ2=6.117，P<0.05)；T-SPOT.TB试验与TST15、结核抗体试验和病理学检查诊断脊柱结核的阳性预测值比较差异无统计学意义(χ2=1.181、2.352、0.001，P>0.05)。T-SPOT.TB试验诊断脊柱结核的阴性预测值显著高于TST5、TST15和结核抗体试验，差异有统计学意义(χ2=9.060、10.356、9.117，P<0.05)；T-SPOT.TB试验与病理学检查诊断脊柱结核的阴性预测值比较差异无统计学意义(χ2=0.047，P>0.05)。

表1 T-SPOT.TB试验、TST、结核抗体试验和病理学检查结果

表2 T-SPOT.TB试验、TST、结核抗体试验、病理学检查对脊柱结核的诊断价值比较

2.2 T-SPOT.TB试验与TST5、TST15、结核抗体试验和病理学检查结果一致性分析结果见表3。一致性分析结果显示，T-SPOT.TB试验与TST5、TST15、结核抗体试验和病理学检查结果一致性检验的Kappa值分别为0.216、0.282、0.080、0.663；T-SPOT.TB试验与病理学检查结果具有高度的一致性。

表3 T-SPOT.TB试验与TST5、TST15、结核抗体试验和病理学检查结果

3 讨论

脊柱结核是肺外结核病的一种，是最常见的骨关节结核，约占骨结核的50%，占肺外结核的15%，占所有结核的2%[11]。脊柱结核大多为继发性，由身体其他部位的结核分枝杆菌通过血液播散而来，其中以肺结核最为常见[12]。脊柱结核发病缓慢，早期并无明显的临床表现，最早出现的症状是轻微的疼痛，体力劳动后加重，同时患者会出现低热、盗汗、食欲不振、消瘦等症状，脊柱结核晚期患者常出现脊柱后凸或侧弯畸形，甚至由于神经被压迫而导致截瘫。早期诊断和有效治疗是延缓病程和降低骨骼损伤的关键。截至目前，尚无某种单一的诊断方法可以检测所有类型的结核病。脊柱结核的延误诊断在临床上较为常见，脊柱结核的诊断已成为一个亟待解决的问题[13]。

目前，脊柱结核的诊断方法包括磁共振成像、TST、血清结核抗体试验、结核分枝杆菌DNA检测、细菌培养、病理学检查等[14]。磁共振成像在脊柱结核的早期诊断中发挥了重要作用，但是需要检测到典型的寒性脓肿才能进行判定。PPD试验和血清结核抗体试验往往会受患者免疫功能的影响，阳性率较低，同时易出现假阳性和假阴性；结核分枝杆菌DNA检测虽然具有很好的敏感度和特异度，但是样本获取较难，不能广泛应用；细菌培养精确可靠，特异度也较高，但是存在培养周期长和阳性率不高的局限性；病理学检查是除了细菌培养外结核诊断的金标准，但是样本的获取往往需要穿刺，存在一定的风险[15-16]。因此，寻找一种高敏感度、特异度及样本获取方便的脊柱结核早期诊断方法至关重要。

γ-干扰素释放试验是近年来逐渐发展起来的新型免疫学诊断方法，在结核的早期诊断中获得了广泛关注，其中T-SPOT.TB试验国内目前应用最为广泛，尤其是对于免疫抑制状态下结核的诊断[17-18]。本研究结果显示，T-SPOT.TB试验诊断脊柱结核的敏感度高于TST5、TST15和结核抗体试验，而与病理学检查诊断脊柱结核的敏感度相当，T-SPOT.TB试验与病理学检查结果具有高度的一致性，而病理学检查是目前公认较好的结核检测方法，说明T-SPOT.TB 试验具有良好的可信性和可行性。

综上所述，T-SPOT.TB诊断脊柱结核的敏感度、与病理学检查结果的一致性均优于TST5、TST15和结核抗体试验，且T-SPOT.TB试验只需要抽取患者静脉血，样本获取方便，适用于早期脊柱结核的诊断。