基于PINK1/Parkin信号通路研究MEHP对小鼠睾丸间质细胞线粒体自噬的影响

宋贝贝，李 玲，2，3，德小明，2，3，李丽萍，2，3，黄金瑞，郭晓英，马慧颖

（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院职业卫生与环境卫生学系，银川 750004；2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004；3.生育力保持教育部重点实验室，银川 750004）

作为环境内分泌干扰物的一种，邻苯二甲酸酯类（phthalates，PAEs）物质因其延展性强、耐高温的特点被广泛用于玩具、医疗材料、装饰材料、化妆品甚至食品包装中[1]。目前研究发现应用最广泛的为邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP），其可通过消化道、皮肤等方式进入人体[2]，DEHP主要的代谢产物为邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP），代谢产物MEHP比其原形毒性更强，在人体蓄积时间更久，对人体危害作用更大[3]。

线粒体过度损伤将会导致细胞内环境稳态的破坏、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水平降低和反应性改变[4]。线粒体去极化是线粒体损伤后膜电位的一种变化趋势，同时也是线粒体自噬过程中的一种早期现象[5-6]。细胞在氧化应激、营养缺乏以及细胞凋亡等因素影响下，会引起线粒体的功能改变[7]。

关于线粒体自噬的分子调节机制目前引起了普遍重视，由同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶1（PINK1）/帕金森蛋白（Parkin）途径介导的线粒体自噬是目前研究发现最广泛的，也是其经典途径之一[8]。PINK1蛋白稳定存在于线粒体外膜上，并被细胞内的蛋白酶所降解，在细胞内呈低水平表达。当线粒体受损，蛋白酶活性降低，使线粒体外膜上的PINK1蛋白水解过程受阻[9]，存在于胞浆中的Parkin被PINK1蛋白不断募集至线粒体外膜上并被磷酸化为P-Parkin[10]。抗增殖蛋白2（PHB2）已经被确定了是PINK1/Parkin介导的线粒体自噬不可缺少的受体蛋白，它也被认为是线粒体自噬的一种标志蛋白[11]。

课题组前期实验结果表明，MEHP可干扰小鼠睾丸间质（TM-3）细胞线粒体功能[12]，但其对线粒体自噬的作用机制尚不清楚。因此本研究拟从PINK1/Parkin途径探讨MEHP对TM-3细胞线粒体自噬水平的影响，并通过自噬抑制剂3-3-甲基腺嘌呤（3-MA）进行验证。

1 材料与方法

1.1 细胞株来源

TM-3细胞（ATCC细胞研究中心，美国）。

1.2 主要仪器

SW-CJ-1CU超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，中国），低温高速离心机（Thermo Fisher Scientific公司，美国），CKX41倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），HF90 CO2培养箱（上海力申科学仪器有限公司，中国），成像系统（Azure Biosystems公司，美国），VICTOR Nivo酶标仪（PerkinElmer公司，美国）。

1.3 主要试剂

MEHP标准品（纯度为99%，Sigma公司，美国），3-MA（Sigma公司，美国），胎牛血清、DMEM培养基、二甲基亚砜（DMSO）、青链霉素混合液（Gibco公司，美国）、胰酶（北京索莱宝科技有限公司，中国），CCK-8细胞增殖检测试剂盒（上海贝博生物科技有限公司，中国），ATP检测试剂盒、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，中国），全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒、ECL检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，中国），PHB2、PINK1、Parkin、P-Parkin、β-actin抗体（Proteintech公司，美国），其他试剂为国产分析纯。

1.4 TM-3细胞复苏、传代、培养及分组

将冻存的TM-3细胞从-80℃冰箱中取出，离心，弃去冻存液，加入4 mL新鲜配制的完全培养基，混匀后接种于培养瓶中。5%CO2培养箱中恒温37℃培养24 h后更换培养液。取对数生长期的TM-3细胞，确立对照组（完全培养基）、MEHP低、中、高剂量组（200、400、800μmol·L-1，剂量均按本课题组前期研究结果设置[12]）和抑制剂组（400μmol·L-1MEHP+1.0 mmol·L-13-MA），继续培养24 h后进行相关检测。

1.5 CCK-8法检测TM-3细胞活性

取对数生长期的TM-3细胞，胰酶消化后配成细胞混悬液（细胞数约2×105个/mL），每孔100μL加入96孔板，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后弃去培养基并加入0、0.25、0.5、1.0、1.25、1.5 mmol·L-16个 浓 度梯度的3-MA。设置对照组、MEHP中剂量组和抑制剂组，培养箱中孵育24 h。各孔中加入10μL的CCK-8检测液，孵育1～2 h后，酶标仪450 nm波长下检测各孔光密度（OD）值并计算细胞活力（%）=［（染毒组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）］×100%。

1.6 化学发光法检测TM-3细胞ATP水平

取TM-3细胞混悬液（细胞数约2×105个/mL）接种于6孔板，培养至细胞贴壁，弃去培养基，设置对照组，MEHP低、中、高剂量组和抑制剂组。培养24 h后用事先冷藏的PBS洗1次，随后裂解细胞。将细胞收集到1.5 mL的离心管中，4℃离心（12 000 r·min-1）5 min。ATP标准溶液稀释为浓度梯度为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μmol·L-1。配制适量的ATP检测工作液于冰上保存。每个检测管中先加入100μL ATP检测工作液，并于室温条件下放置3～5 min，减少背景值。将20μL样品或标准品添加到检测管中，间隔2 s后用化学发光仪测量相对光单位（relative light unit，RLU）值。根据标准曲线计算待测样品中ATP的浓度。

1.7 荧光探针JC-1法检测TM-3细胞线粒体膜电位水平

将处于对数增殖期的TM-3细胞以2×105个/mL的密度接种于6孔板中，孵育24 h后，设置对照组、MEHP低、中、高剂量组和抑制剂组，细胞培养24 h。每孔细胞培养液和JC-1染色工作液各1 mL，混合均匀，孵育20 min。孵育期间，按照JC-1染色缓冲液（5×）和蒸馏水1∶4的比例，准备适量的JC-1染色缓冲液（1×），冰浴。37℃孵育结束后，弃上清，裂解细胞并收集，4℃，600×g，离心3 min，沉淀细胞，弃上清。用1×JC-1染色缓冲液洗2次，加入1 mL的1×JC-1染色缓冲液重悬细胞，600×g，4℃，离心3～4 min，沉淀细胞，弃上清。重复2次后用适量1×JC-1染色缓冲液使细胞重新悬浮。酶标仪激发光设置为490 nm，发射光设置为530 nm检测JC-1单体；激发光波长设置为525 nm，发射光波长设置为590 nm，检测JC-1聚合物。

1.8 Western blot检测TM-3细胞PHB2、PINK1、Parkin、P-Parkin蛋白表达水平

将处于对数增值期的TM-3细胞，以2×105个/mL的密度接种于100 mm培养皿，细胞贴壁后分别设置对照组、MEHP低、中、高剂量组和抑制剂组，细胞培养24 h。弃去各组培养基，用事先预冷的PBS洗2次，裂解细胞，将细胞收集至1.5 mL的离心管中，振荡30 s后在冰上放置4 min，重复操作5次后离心（4℃，12 000 r·min-1）5 min，得上清为全蛋白。测定蛋白浓度并对蛋白进行变性处理。配胶、上样、电泳、转膜、封闭2 h后加入一抗4℃冰箱过夜。二抗室温孵育1 h后曝光。采用Image J软件分析目的条带的灰度值。

1.9 统计学方法

数据采用SPSS 23.0统计学软件进行分析。每项实验均重复3次以上，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3-MA抑制剂对TM-3细胞活性的影响

预实验设置3-MA为0、0.25、0.5、1.0、1.25、1.5 mmol·L-16个浓度梯度，干预24 h后测定OD值。CCK-8结果显示：TM-3细胞存活率呈现先上升后下降的趋势，与对照组相比，1 mmol·L-13-MA处理TM-3细胞24 h后细胞存活率为（99.56±2.51）%（P＞0.05），见表1。确定后续3-MA抑制剂干预剂量为1 mmol·L-1。进一步检测各处理组对于细胞活性的影响，结果表明：与对照组相比，MEHP中剂量组细胞存活率降低（P＜0.01）；与MEHP中剂量组相比，抑制剂组细胞存活率降低（P＜0.05），3组结果表现为：抑制剂组细胞存活率＜MEHP染毒组细胞存活率＜对照组，见表2。

表1 3-MA对TM-3细胞存活率的影响（±s）

表1 3-MA对TM-3细胞存活率的影响（±s）

与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

3-MA浓度/（mmol·L-1）0 0.25 0.5 1.0 1.25 1.5 n 3 3 3 3 3 3细胞存活率/%100.00±0.00 116.70±4.16**106.28±2.32*99.56±2.51 81.96±3.21**71.35±2.08**

表2 CCK-8法检测TM-3细胞存活率的变化（±s）

表2 CCK-8法检测TM-3细胞存活率的变化（±s）

与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与中剂量组比较#P＜0.05。

组别对照组中剂量组抑制剂组n 3 3 3细胞存活率/%100.00±0.00 47.68±3.16**39.56±2.51*#

2.2 MEHP染毒对TM-3细胞ATP水平的影响

与对照组相比，MEHP各染毒组均可引起TM-3细胞ATP水平下降（P均＜0.05）；与低剂量组相比，高剂量组TM-3的ATP水平下降（P＜0.05）；与中剂量组相比，高剂量组、抑制剂组TM-3的ATP水平均降低（P均＜0.05），见表3。

表3 不同浓度MEHP染毒对TM-3细胞ATP水平的影响（±s）

表3 不同浓度MEHP染毒对TM-3细胞ATP水平的影响（±s）

与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01；与低剂量组相比$P＜0.05；与中剂量组相比#P＜0.05。

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组抑制剂组F值P值n 3 3 3 3 3 ATP相对水平/（nmol·g-1）9.01±0.58 7.53±1.30*7.44±0.21*6.74±0.41**$#5.83±0.26*#28.96＜0.05

2.3 MEHP染毒对TM-3细胞线粒体膜电位水平的影响

与对照组比较，中、高剂量组TM-3细胞线粒体膜电位均下降（P均＜0.05），随着染毒浓度的增加，线粒体膜电位呈下降趋势；与低剂量组相比，中、高剂量组TM-3细胞线粒体膜电位水平均下降（P均＜0.05）；与中剂量组相比，高剂量组、抑制剂组细胞线粒体膜电位水平均降低（P均＜0.05），见表4。

表4 MEHP对TM-3细胞线粒体膜电位的影响（±s）

表4 MEHP对TM-3细胞线粒体膜电位的影响（±s）

与对照组相比*P＜0.05；与低剂量组相比$P＜0.05；与中剂量组相比#P＜0.05。

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组n 3 3 3 3 JC-1红色荧光聚合物 JC-1绿色荧光单体 红色荧光聚合物/红色荧光单体100.00±3.68 100.00±4.21 100.00±2.68 96.43±5.02 97.66±6.47 98.76±4.38 75.42±2.72 113.16±3.28 63.28±5.65*$70.62±4.33 125.82±2.56 55.23±3.27*$#抑制剂组 3 F值 114.3 P值 ＜0.05 66.93±1.32 140.28±0.34 44.17±0.85*#

2.4 MEHP染毒后TM-3细胞内PHB2、PINK1、Parkin、P-Parkin蛋白表达水平变化

与对照组相比，MEHP各染毒组TM-3细胞PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白表达水平均升高（P均＜0.05）；低剂量组Parkin蛋白的表达水平与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），中、高剂量组Parkin蛋白的表达水平均低于对照组（P均＜0.05）；与低剂量组相比，中、高剂量组TM-3细胞中PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白相对表达水平均上升（P均＜0.05），中、高剂量组TM-3细胞中Parkin蛋白相对表达水平均下降（P均＜0.05）；与中剂量组相比，高剂量组TM-3细胞中PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白相对表达水平均上升（P均＜0.05），高剂量组TM-3细胞中Parkin蛋白相对表达水平下降（P＜0.05），见图1。

图1 不同MEHP染毒对TM-3细胞线粒体自噬相关蛋白的影响

抑制剂组PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白的相对表达水平均低于中剂量组（P均＜0.05），Parkin蛋白的表达水平高于中剂量组（P＜0.05），见图2。

图2 不同处理组对TM-3细胞线粒体自噬相关蛋白的影响

3 讨论

DEHP为塑胶制品常用的一种塑化剂，无色、无味，因可作为食品包装、化妆品以及玩具的原料，在日常生活中随处可见，被列为人类潜在致癌物[13]。DEHP在肠道中经过水解酶的作用后大部分代谢为毒性更强、作用更久的MEHP[14]。有机物被细胞摄入后，其中储存的能量转换为ATP。因此，线粒体结构和功能受损后，最先受影响的是细胞的能量供应系统，进而继发一系列供能不足的反应。线粒体自噬是维持线粒体内环境稳定的重要过程，其中研究最为广泛的是PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬，它由PTEN诱导的PINK1和Parkin调节。正常情况下，线粒体外膜上的PINK1蛋白会被迅速水解，从而在细胞内维持低表达水平。但线粒体受损时，线粒体膜电位降低，PINK1蛋白不会被水解，会稳定地聚集于线粒体外膜上。其进一步招募Parkin蛋白转位到受损线粒体的外膜上，激活Parkin的泛素化活性，线粒体外膜破损，继而暴露线粒体内膜蛋白PHB2，从而进一步激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬下游通路。线粒体外膜破裂后暴露出的PHB2是与吞噬泡上LC3蛋白结合的一个关键位点，PHB2的缺失将会导致吞噬泡不能识别受损线粒体，阻断线粒体自噬[15]。研究[16]发现，MEHP所致的雄性生殖毒性机制涉及多种病理学变化，包括线粒体损伤和自噬功能障碍等。

本研究结果显示，与对照组相比，随着染毒剂量增加，细胞内ATP含量逐渐减少，中、高剂量组线粒体膜电位下降，提示MEHP染毒后TM-3细胞线粒体发生了损伤，线粒体ATP合成减少，膜电位下降。本课题组前期研究[12]表明，MEHP染毒可减少TM-3细胞睾酮的分泌，并引起线粒体损伤，与本研究结果相互验证。与中剂量组相比，加入自噬抑制剂后细胞内ATP水平和膜电位下降，提示MEHP染毒后诱导TM-3细胞发生了自噬，且自噬起保护作用。伊梦楠等[17]研究发现，MEHP可诱导自噬的发生，与本研究结果相互印证。Western blot结果显示，与对照组相比，MEHP染毒后TM-3细胞的PINK1、P-Parkin、PHB2表达水平升高，Parkin蛋白的表达水平降低，表明TM-3细胞中受损线粒体增多，PINK1无法进入线粒体内被降解清除，致使积聚于受损线粒体外膜上的PINK1通过募集游离于细胞质中的Parkin至线粒体外膜，从而启动TM-3细胞线粒体的自噬。高言[11]的研究显示，氟诱导TM-3细胞线粒体膜电位下降，PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白表达量升高，上述发现与本研究结果相似。为了检测PINK1/Parkin途径介导的线粒体自噬在MEHP诱导TM-3细胞毒性中起何作用，利用自噬抑制剂3-MA，通过CCK-8法检测细胞增殖活性来判断3-MA对MEHP产生的细胞毒性并确定1.0 mmol·L-1的3-MA为后续实验浓度。从实验结果来看，3-MA干预后，MEHP对细胞活力的抑制作用增强，PINK1、PParkin、PHB2蛋白表达水平下降，Parkin蛋白的表达水平增高，提示加入3-MA抑制剂后，TM-3细胞线粒体自噬被抑制，MEHP产生的细胞毒性增大。

综上所述，MEHP可能通过激活PINK1/Parkin信号通路来诱导TM-3细胞线粒体的自噬，为阐明MEHP雄性生殖毒性的分子机制提供了科学的实验及理论依据。