磁性纳米颗粒固定蛋白酶研究

祝启张，刘莉彬，胡 珊，韩孟婷，邓 辉

（1. 皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安 237012；2. 安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽六安 237012）

木瓜蛋白酶是一种水解蛋白酶，具有较强的水解蛋白能力，番木瓜果实的新鲜乳汁中就含有木瓜蛋白酶，具备凝乳、蛋白合成等多项功能，在生产方面也得到普遍的运用[1]。但对比二者的稳定性，游离的木瓜蛋白酶没有固定的木瓜蛋白酶好，使用后，有学者发现相比固定化酶来说，游离酶更难分离提炼出来，传统的酶固定化载体又存在很多问题，因而对酶的固定化优化进行了海量的探讨和研究。

Fe3O4磁性纳米颗粒是当代发展起来作为酶固定化的优良新型载体材料。对比以前用的酶载体材料，经Fe3O4磁性纳米颗粒固定化后的蛋白酶更容易被提炼分离出来，并重复使用以节约成本，并且固定化酶在反应体系中的运动轨迹、方向及方式方法可以通过场外施加磁场来控制，解决了很多以前机械搅拌所造成的一系列问题，必将在日后酶固定化技术的应用中得到广泛关注[2]。为此，以实验室现已制备所得的Fe3O4磁性纳米材料作为酶的固定化载体，探讨Fe3O4磁性纳米材料固定化木瓜蛋白酶会对木瓜蛋白酶产生哪些影响，并对Fe3O4磁性纳米材料固定化木瓜蛋白酶的最适温度、最适温度下酶的热稳定性及各种固定化处理后酶的酶活保留率进行研究。

1 试验方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

硫酸亚铁，无锡市展望化工试剂有限公司提供；氯化铁、三氯乙酸，国药集团化学试剂有限公司提供；浓盐酸，上海振企化学试剂有限公司提供；氢氧化钠，西陇化工股份有限公司提供；木瓜蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司提供；酸水解酪氨酸、L-半胱氨酸，上海源聚生物科技有限公司提供；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸，上海试剂一厂提供；海藻酸钠、氯化钙，均为分析纯，天津市光复精细化工研究所提供。

1.1.2 仪器

UV-5500 型紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；DK-8D 型三孔三温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司产品；电热恒温鼓风干燥机，上海福玛实验设备有限公司产品；冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产品；H2050R 型医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；磁铁，苏州龙顺磁铁有限公司产品。

1.2 磁性颗粒的合成方法

四氧化三铁磁性纳米颗粒通过化学共沉淀法合成[3]，将50.0 mmol 的Fe3O4和100.0 mmol FeCl3和100.0 mL，0.06 mol/L 的HCl 溶液于烧杯中相溶在一起。待溶液呈黄褐色透明状后，在25 ℃下，再用玻璃棒强烈的搅动，将配置好的1.5 mol/L 氢氧化钠溶液细心地倒入上述混合液中，待烧杯中的混合溶液的颜色发生变化，由黄褐色转变为黑色后。在室温下放置大约30 min，将水浴锅中水的温度升至70 ℃，将溶液放置在水浴锅中进行水浴晶体化2 h。用磁铁将Fe3O4磁性纳米颗粒吸附在烧杯的底部，用去离子水清洗多次之后，即可得到磁性纳米颗粒。

1.3 固定化木瓜蛋白酶的制备

准确称取10 g Fe3O4磁性纳米颗粒加入1.5 mg/mL木瓜蛋白酶溶液1 L，pH 值7，温度为50 ℃条件下在水浴锅中缓慢振荡反应30 min 后，用磁铁吸附分离Fe3O4磁性纳米颗粒于烧杯底部，倾倒烧杯上层的液体， 经过干燥就可得到Fe3O4磁性纳米颗粒，用去离子水清洗数次，以完全洗去未经吸附的游离木瓜蛋白酶，所得到的Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶用于后续试验操作[4]。

1.4 酶活测定

酶活的定义[5]：一个酶活单位是指1 min 内木瓜蛋白酶分解酪蛋白产生1 μmol 酪氨酸，详细操作步骤如下：

用移液管向1 mg/mL 酶溶液5 mL 中加入激活剂（2 mmol/L L-半胱氨酸和1 mmol/L 乙二胺四乙酸在pH 值7.0 磷酸缓冲液中的混合液5 mL）。置于最适温度下在水浴锅中水浴5 min，再用移液管向混合液中掺入质量浓度为5 g/L 的底物酪蛋白溶液5 mL，反应5 min 后向以前的混合溶液中加入5 mL 质量分数为5%的三氯乙酸溶液[6]抑制木瓜蛋白酶的活性终止木瓜蛋白酶的催化反应，之后用紫外分光光度计在波长275 nm 处测定溶液中酪氨酸的质量浓度[7]（根据在波长275 nm 处测得的酪氨酸质量浓度标准曲线Y=170.32X-0.214 5，R2=0.997 计算得酪氨酸的浓度）。

1.5 测定游离的和固定化木瓜蛋白酶的最适温度

Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶和游离的木瓜蛋白酶在55，60，65，70，75，80 ℃下进行反应，于波长275 nm 处采用紫外分光光度法分别测定Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶和游离的木瓜蛋白酶的最适温度（酶活最高者为100%）[8]。

1.6 测定游离的和固定化木瓜蛋白酶在最适温度下的热稳定性

取一定量的Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶和游离的木瓜蛋白酶各6 份，在pH 值7 的磷酸缓冲溶液中分别放置游离的木瓜蛋白酶和Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶，并于其相对应的最适温度下保温1，2，3，4，5，6 h，测试各时间段木瓜蛋白酶的酶活性，以0 h 的木瓜蛋白酶的酶活性为100%，计算各时间段木瓜蛋白酶的相对酶活力[9]。

1.7 测定固定酶的酶活保留率

将Fe3O4磁性纳米颗粒干燥后形成的磁粉与质量分数为4%的海藻酸钠按质量比3∶5 混合成均匀的胶体4 mL，并向均匀的胶体中加入一定质量的木瓜蛋白酶，混合均匀后用6 号注射器将上述混合的胶体逐滴滴入质量分数为1%的CaCl2溶液中静置30 min，再用1.5%的C5H8O2（质量分数） 交联1 h，收集Fe3O4磁性颗粒协同海藻酸钠包埋产生的包埋粒，用去离子水反复清洗数次，以完全去除未固定的木瓜蛋白酶和多余的C5H8O2，并测定各种固定方法下固定的和游离的木瓜蛋白酶的总酶活力，计算木瓜蛋白酶的酶活保留率[10]。（制备海藻酸钠固定木瓜蛋白酶时，除去不加Fe3O4，其他步骤同上。其中，酶活保留率=固定酶总酶活力/游离酶总酶活力）

2 结果与分析

Fe3O4磁性纳米颗粒粒径较小、比表面积比较大，赋予了木瓜蛋白酶较大的比表面积，可为木瓜蛋白酶的固定化提供更多的吸附位点。Fe3O4磁性纳米颗粒具有磁性吸附力，可利用通过施加场外磁力进行搅拌及回收再利用。而Fe3O4磁性纳米颗粒协同海藻酸钠固定的木瓜蛋白酶能通过外加磁场进行磁力搅拌、分离回收，相较于海藻酸钠固定的木瓜蛋白酶而言, Fe3O4磁性纳米颗粒协同海藻酸钠固定的木瓜蛋白酶能够在完成催化后更好地回收再利用。

2.1 木瓜蛋白酶的最适温度

温度对酶活性的影响见图1。

图1 温度对酶活性的影响

由图1 可知，游离的木瓜蛋白酶的最适温度是65 ℃，而Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶的最适温度是75 ℃，游离的木瓜蛋白酶的最适温度比Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶的最适温度下降了10 ℃。当反应温度高于木瓜蛋白酶的最适温度时，随着温度的不断攀升，游离的木瓜蛋白酶的酶活性快速下降，而Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶的酶活性下降速度相对于游离的木瓜蛋白酶的酶活性下降速度要慢一些，说明Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶的酶活性受温度影响较小，可能是Fe3O4磁性纳米颗粒的屏蔽作用对木瓜蛋白酶起到一定的保护作用。

2.2 木瓜蛋白酶的热稳定性

酶的热稳定性见图2。

图2 酶的热稳定性

由图2 可知，在最适温度下，Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶在最适温度下6 h 后，酶的相对酶活力仍保持原先的62.5%，而游离的木瓜蛋白酶的相对酶活力只有原先的24.7%，由试验结果可得出，游离的木瓜蛋白酶的热稳定性显著低于Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶的热稳定性。结果很可能是Fe3O4磁性纳米颗粒吸附木瓜蛋白酶阻止了木瓜蛋白酶的聚集和改变了木瓜蛋白酶的空间结构造成的。

2.3 固定化酶的酶活保留率

各种形式木瓜蛋白酶的酶活保留率见表1。

表1 各种形式木瓜蛋白酶的酶活保留率

由表1 可知，Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶的酶活保留率为42.86%，海藻酸钠固定木瓜蛋白酶的酶活保留率为52.61%，Fe3O4磁性纳米颗粒协同海藻酸钠固定木瓜蛋白酶的酶活保留率为69.44%，Fe3O4磁性纳米颗粒协同海藻酸钠固定木瓜蛋白酶的酶活保留率比Fe3O4磁性纳米颗粒固定木瓜蛋白酶和海藻酸钠固定木瓜蛋白酶的酶活保留率都要高，可能是Fe3O4磁性纳米颗粒的静电吸附作用产生的影响, Fe3O4磁性纳米颗粒协同海藻酸钠包埋木瓜蛋白酶时，Fe3O4磁性纳米颗粒周围因为静电作用聚集了更多的酶，所以在海藻酸钠包埋时可固定更多的木瓜蛋白酶，提升木瓜蛋白酶的酶活保留率。

固定的木瓜蛋白酶的酶活保留率比游离的木瓜蛋白酶的酶活保留率下降了，造成的结果可能是在固定过程中游离的木瓜蛋白酶并没有全部固定于载体上，有一部分随着洗涤流失了，还有可能是木瓜蛋白酶固定在载体上形成了空间阻碍并改变了木瓜蛋白酶的空间结构，以及戊二醛在交联的过程中抑制了木瓜蛋白酶的部分活力造成的。

3 结论

以Fe3O4磁性纳米颗粒作为木瓜蛋白酶的固定化载体，Fe3O4磁性纳米颗粒固定木瓜蛋白酶的酶活保留率为42.86%，海藻酸钠固定的木瓜蛋白酶的酶活保留率为52.61%，Fe3O4磁性纳米颗粒协同海藻酸钠固定的木瓜蛋白酶的酶活保留率为69.44%。游离的木瓜蛋白酶的最适温度是65 ℃，Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶的最适温度是75 ℃，游离的木瓜蛋白酶的最适温度比Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶的最适温度下降了10 ℃，Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶在最适温度下的热稳定性也明显改善。Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶在使用过程中可以通过操作外部磁场来控制Fe3O4磁性纳米颗粒固定的木瓜蛋白酶在反应体系中的运动轨迹、速度、方式及方法，取代了传统的机械搅拌，降低了因机械搅拌而损伤的酶活性，提高了Fe3O4磁性纳米颗粒固定化酶的酶活性，进一步提高了Fe3O4磁性纳米颗粒固定化酶的活性保留率及催化效率，经Fe3O4磁性纳米颗粒固定化后的蛋白酶更容易被提炼分离出来。从Fe3O4磁性纳米颗粒协同海藻酸钠固定木瓜蛋白酶的酶活保留率比Fe3O4磁性纳米颗粒和海藻酸钠单独固定木瓜蛋白酶的酶活保留率要高，可以看出Fe3O4磁性纳米颗粒协同包埋材料相互协作能更好地起到固定酶的作用。另外，Fe3O4磁性纳米颗粒还可作为标记物用于研究酶在人体内的作用位点，因而Fe3O4磁性纳米颗粒表现出了强大的市场竞争优势，是酶固定化的优良载体。