茚二酮显现潜在手印的应用研究进展

陆一帆，罗亚平

(中国人民公安大学 侦查学院，北京 100038)

茚二酮是一种双环芳烃β-二酮类化合物，应用于科学、工业众多领域，在有机合成、医药和染料生产中常用作基质。茚二酮衍生物及其类似物在医学、化学和司法等领域具有重要的应用价值。1997年，Ramotowski在Jouille及其同事与美国特勤局提出以茚二酮作为渗透性客体手印显现试剂[1]。茚二酮是茚三酮的类似物，显现汗潜手印的原理是与汗液中的氨基酸、多肽、蛋白质发生反应，氨基酸分子中的α-氨基和α-羧基在酸性和加热条件下由于茚二酮作用发生氧化脱氢，与胺反应形成亚胺，再脱羧降解生成2-氨基-1-茚酮，然后与过量茚二酮进一步发生反应，生成橙色荧光络合物，自然光下呈现浅粉色(焦利粉)，在绿光激发下透过橙色滤光片呈明亮的橙黄色[1-3]，可在激光或多波段光源照射下观察并拍照提取。之后，各国研究人员对茚二酮作为手印显现试剂的效果进行了研究并成功应用于实际案件。

1 茚二酮显现潜在手印配方

潜在手印显现技术多种多样，茚二酮是渗透性客体表面汗潜手印的常用显现试剂之一。显现需将茚二酮粉末配置成工作液，浸润客体后晾干，在一定条件下静置或加热[4-5]。目前各机构和实验室工作液配方和显现条件各不相同，可能归因于气候环境条件的差异和纸浆类型、添加剂种类以及纸张回收利用水平的区别。针对澳大利亚、新西兰、美国、欧洲的主要手印研究团队和警察实验室的一项调查显示，各地茚二酮配方差异较大(见表1)。

1.1 茚二酮

用于手印显现的茚二酮主要指1,2-茚二酮，研究人员也对茚二酮衍生物的作用进行了探索。邻近的环二酮类化合物也可用于潜在手印显现，但是不及1,2-茚二酮及其许多单、二甲氧基衍生物的荧光性能优越。4,5-二甲基-1,2-茚二酮在灵敏度和显现牛皮纸上潜在手印的荧光效果方面优于1,2-茚二酮。赵雅彬团队合成并应用了5,6-二甲氧基-1,2-茚二酮，实验结果显示其效果优于1,2-茚二酮，也有研究人员认为1,2-茚二酮与5,6-二甲氧基-1,2-茚二酮均能较好显现印刷品上的新鲜手印，效果大致相同。

表1 各地茚二酮配方[5]Table 1 Indanedione formulations in various places[5]

1.2 极性溶剂

为保证工作液的稳定性，配置茚二酮工作液需加入极性溶剂。Wiesner研究了工作液pH值对显现的影响，认为不含乙酸的配方效果更好[6]。然而，多数机构认为乙酸是可以增强手印荧光的重要成分[7]。

甲醇在溶解茚二酮的过程中会产生半缩酮，该结构的共轭程度较低，会使溶液呈现出更浅的颜色甚至无色(茚二酮粉末为黄色，不含醇类的工作液呈淡黄色)，含甲醇的茚二酮试剂在480 nm处的吸光度峰值显著降低也证实了这一点[7-8]。半缩酮可以促进茚二酮与氨基酸的反应正向进行，从而提髙含甲醇配方的显现效率和手印的荧光亮度，但是阻碍了焦利粉反应产物的形成，显现出的手印痕迹在自然光下呈现极浅的粉色。乙醇在溶解茚二酮的过程中也会产生半缩酮，因产量较小对反应的促进作用不大，但是乙醇极性小，可以保护检材，相反甲醇极性较大，过量甲醇会导致手印纹线扩散，影响后续鉴定工作[9]。

1.3 载体溶剂

载体溶剂在茚二酮工作液中占比最高，《茚三酮显现潜在手印方法的评估》[10]中指出，必须优先选用对健康和环境危害尽可能小的载体溶剂，所以应避免使用环己烷和石油醚等。各类相对安全环保的载体溶剂也被陆续引入茚二酮工作液。

研究人员提出用不易燃且相对环保的HFE 7100(九氟丁基甲醚)、HFC 4310mee(1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-十氟戊烷)和HFE 71de(HFE 7100和1,2-二氯乙烯的混合物)替代原载体溶剂。各新兴载体溶剂对灵敏度、稳定性和荧光亮度的影响存在争议，多数研究认为HFE 7100=HFE 71de>HFC 4310mee>石油醚。但是Bicknell的实验显示石油醚比HFE 7100效果好，焦利粉颜色更深、荧光亮度更强并且成本更低[11]。HFE 71de相比其他两种溶剂会溶解冲散更多油墨，对书写、印刷的检材造成破坏，并且含有1,2-二氯乙烯(对人体有毒性)[12]，目前HFE 7100是综合评价最高的茚二酮载体溶剂。

由于含氟温室气体造成的全球变暖效应，欧盟考虑对部分氢氟酸溶剂实施禁令，关于含氟温室气体的欧洲议会和欧盟理事会法规(EU)NO 517/2014已于2015年1月1日正式实施，HFE 7100作为附件二所列具有全球变暖潜能值的“其他氟化温室气体”，虽未被禁用，但生产、进出口等都受到了一定限制。Olszowska等团队已证明全球变暖潜能值更低的Solstice-PF替代HFE 7100具有可行性[13-14]。

1.4 锌化

英国、澳大利亚、美国等都提出锌盐进一步处理茚二酮工作液浸润过的检材可以提高灵敏度，也可以增强手印荧光[11,15-16]。澳大利亚的研究人员尝试直接在茚二酮工作液中加入锌盐(氯化锌或硝酸锌)以简化锌化步骤，也取得了良好的手印显现效果：灵敏度更高、荧光亮度更强[12]，锌盐还可以提高试剂的稳定性，降低显现对环境相对湿度的依赖[17-18]。茚二酮和潜在手印氨基酸之间的反应对环境湿度非常敏感，少量锌离子(茚二酮和锌的摩尔比为1∶25～1∶4)可以以路易斯酸的形式作为茚二酮与氨基酸反应的催化剂，在较低相对湿度环境下，稳定限速水解过程中关键中间体1,3-偶极子水解转化为2-氨基-1-茚酮，增强手印显现效果，相对湿度较高时，催化作用不明显。同时锌离子可以通过稳定作为反应产物的荧光团，提高荧光手印的持久性[3]。Bicknell测得茚二酮/锌工作液在3个月内可以保持稳定[11]，非锌化工作液的有效期长达1年，保质期大大降低是锌化试剂的缺点，可通过将茚二酮与锌盐试剂分别保存、用时混合来解决。Berdejo则认为在茚二酮中添加氯化锌并不能进一步改善荧光手印显现效果[19]。

2 茚二酮显现潜在手印处理条件

2.1 温度和湿度

最初茚三酮处理的检材通常需要在室温下放置多天才能显现出手印，20世纪70年代初，检验人员开始使用蒸汽熨斗加热加湿茚三酮处理过的检材，多方实验最终确定茚三酮显现潜在手印最佳处理条件是80 ℃和相对湿度65%[7]。

在茚二酮的应用研究中，可能由于气候变化导致的实验环境差异，来自不同国家、同一国家不同地区研究人员的实验结果不尽相同。各地多数要求对晾干后的检材进行加热处理，但是对是否加湿要求不一致。英国倾向于在0%相对湿度下100 ℃加热，相对湿度60%及以上或者温度超过120 ℃都会减弱手印荧光，低至20 ℃长时间放置，茚二酮和氨基酸的反应也可以顺利进行[7]。在以色列，加热和60%相对湿度加湿是最佳显现条件[20]，另有以色列研究人员发现将检材冷却到液氮温度能显著增强手印荧光[6]。在澳大利亚和新西兰环境条件下，用热压板加热比用烘箱加热具有更好的荧光效果，最佳条件是160～165 ℃的热压板加热10 s，同时建议使用茚二酮-茚三酮-物理显影液的顺序显现纸张上的潜在手印。将检材浸润在工作液中两次并延长加热时间，也可以增强纸张上手印的颜色和荧光。显然茚二酮显现手印有必要根据环境确定处理条件。

水分是手印显现的关键，茚二酮与氨基酸的反应能否顺利进行在很大程度上取决于环境的相对湿度[3]。高湿度会导致氨基酸扩散，所以氨基酸灵敏试剂不适用于被浸泡过的检材，也不适用于保存在高湿度环境下的陈旧检材，接近纸张饱和的高湿度也会导致焦利粉水解降解为1,2-茚二酮或茚二酮衍生物，降低显现灵敏度。当相对湿度在60%以下时，茚二酮与氨基酸的反应相对较差，显现效果大大降低[18]。低湿度条件下，特别是在工作液中不添加氯化锌的情况下，70～100 ℃长时间加热会导致生成非荧光低聚物，影响手印荧光亮度。有锌盐加入的工作液会减少相对湿度、纸张含水量和环境的局部波动对显现反应的影响。当茚二酮与氯化锌的摩尔比为1∶25～1∶5时，茚二酮与氨基酸的反应速率与在70%相对湿度以上时的反应速率相同[3]，摩尔比接近1∶1时不能改善手印荧光，且对生成焦利粉的反应有不利影响。这些结论在一定程度上解释了世界各地研究人员关于茚二酮作为手印显现试剂的有效性和处理条件的结果相互矛盾。

2.2 承痕客体

承痕客体在茚二酮与氨基酸之间的反应中起着多种作用。纸张基质中纤维素的作用类似于表面催化剂，稳定早期反应的中间体，还能将水分子固定在反应位点附近[3,8]，通过氢键相互作用促进焦利粉的形成，进一步提高反应速率、增强荧光；纤维素对荧光产物也有稳定作用，可以延缓焦利粉的降解。多数商务票据纸张中所含微量金属可以作为路易斯酸催化剂，以与锌离子相同的方式促进反应进行[21]。

2.3 荧光效果

茚二酮处理后的检材需特定光源激发出反应产物的荧光，再使用OG590长通滤光片观察手印，460,532,577 nm光源均可以激发出强烈荧光，其中532 nm效果最好，手印荧光强且与背景反差较大[22]。氨基酸种类对光谱没有影响，各类氨基酸的吸收光谱和荧光光谱是一致的。茚二酮与氨基酸的反应产物易光解，经茚二酮显现的手印在黑暗中保存时间更长，在室温条件下比较稳定，降解缓慢，其荧光在第一周开始下降，并在近两周内达到稳定水平[23]。

3 茚二酮显现潜在手印的应用

3.1 对DNA的影响

接触DNA检验是当前DNA检验最常见的类型[24]，在显现潜在手印之前收集接触DNA可能会破坏手印痕迹[25]，对潜在手印进行一定处理后能更准确地定位接触位置、确定提取点，所以需要在尽可能不破坏DNA的情况下显现潜在手印[26]。茚二酮工作液成分不会对DNA造成损害，但是显现操作过程会遗失少量DNA。所以茚二酮处理对提取接触DNA造成的影响主要体现在PCR定量，Haneul采用茚二酮显现烟蒂上的汗潜手印后进行DNA提取和实时荧光定量PCR，与对照组相比DNA恢复量减少了27%[27]。但是茚二酮处理能显现接触点的精确位置并且不破坏STR分型[28]，Galinsky使用茚二酮处理纺织物，近86%的检材显现出荧光区域，为检验接触性疑难检材提供了新的思路：使用茚二酮定位接触区域，确定位置集中采集DNA[29]。

茚二酮处理和DNA提取的时间间隔对提取分析成功率影响较大，茚二酮处理后需尽快提取DNA，经处理的手印6 d内可以检测到完整的DNA图谱[30]。

3.2 其他显现方法比较联用

显现渗透性客体汗潜手印的化学显现法包括硝酸银、茚三酮、茚二酮、DFO和物理显影液等。硝酸银法对曝光有较高要求，所以较少使用。茚三酮、茚二酮、DFO的显现原理都是与手印中的氨基酸、多肽以及蛋白质发生反应，能显现遗留时间较长的汗潜手印，是显现渗透性表面手印常用的试剂，其中DFO和茚二酮都是常见的荧光试剂[4]。

案件中物理显影液的手印显现率高于茚二酮，但是物理显影液操作复杂且会破坏DNA结构[31]。自然光观察已处理的汗潜手印时，茚三酮比茚二酮和DFO效果更好，因为其手印颜色更深，与背景反差较大。最初茚二酮合成困难，导致其可用性有限，在未锌化和确定最佳显现条件之前，同为荧光试剂的DFO比茚二酮普及率更高。茚二酮处理导致的底物染色程度比DFO低，但是多数实验结果显示DFO的显现效果优于当时的茚二酮。

茚二酮工作液配方和显现条件进一步优化后，在大多数底物上显现的手印质量都高于茚三酮和DFO[6,19,32-37]，显出率比茚三酮高46%[6]，荧光亮度甚至可以达到DFO处理的四倍[11]。2002年，茚二酮通过总部位于荷兰的BVDA International公司进入市场，合成方法优化使原料稀缺问题得到解决。至此，茚二酮在显现渗透性客体手印的顺序中可以同时取代茚三酮和DFO。

推荐渗透性客体汗潜手印显现顺序为光学方法显现-茚二酮-茚三酮-物理显影液。因陈旧手印氨基酸扩散，灵敏度高的茚二酮反而不易显现出清晰纹线，有时候茚三酮的后处理可以得到更符合鉴定要求的手印，茚三酮的鲁赫曼紫会完全吸收荧光，所以茚三酮应在茚二酮之后使用。茚二酮显现后用茚三酮处理与单一使用茚三酮处理相比，前者的茚三酮对氨基酸的消耗更大，原因之一可能是在茚二酮第一次处理过程中，沉积的氨基酸与纸张之间的物理连接减弱，使这些氨基酸更容易与茚三酮反应，这种双重应用显著提高显现纸张上潜在手印的成功率[38]。茚二酮对渗透性客体上的潜血手印也具有良好的显现效果，显现新鲜血潜手印茚二酮的效果优于DFO和茚三酮，显现遗留7 d以上的潜血手印则DFO灵敏度更高。

3.3 疑难客体显现

茚二酮是单氨基酸灵敏试剂显现汗潜手印的传统方法中最有效的，在牛皮纸和红色书写纸张上的显现效果相对较差，适合复杂背景渗透性客体(无荧光性质)上的含氨基酸手印的显现处理，在显现疑难客体手印方面表现优异。

Michal使用茚二酮成功显现火车票(以色列)上的潜在手印，由于热敏材料受热发黑，在使用茚二酮工作液浸泡晾干后需常温静置12 h以上[39]；李力使用不含醇的茚二酮工作液处理热敏纸，可以在纸张不变黑的情况下显现手印[40]；Sungwook用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)与锌化茚二酮联用，制备出显现热敏纸表面潜在手印的最佳配方[41]。易祥冰用多种方法对硅油纸张上的潜在手印进行显现，其中茚二酮配合激光器显现效果最佳。任建新测得茚二酮工作液处理后卫生纸和热敏纸的最佳处理温湿度均低于白纸、牛皮纸和报纸[42]。王聪使用茚二酮成功显现流通和未流通的人民币上的潜在手印[43]。茚二酮还是显现血潜手印化学方法顺序的首选之一。

茚二酮在真空条件下可以应用于非渗透客体，也成功显现手套内侧的手印，但是效果较差[44]，相比非渗透性客体专用显现方法，不建议使用茚二酮。

4 结论和展望

渗透性客体上比非渗透性客体上更容易显现出潜在手印[45]，茚二酮法作为一种潜在手印显现方法，能够应用于大多数渗透性客体上潜在手印的显现。自1997年应用于手印显现至今，已经凭借灵敏度高、荧光效果好、操作简便、可应用于复杂背景客体等优势在各国警察部门得到广泛应用，茚二酮不影响接触DNA分型以及对接触痕迹的有效显现，为集中采集DNA提供了条件。1,2-茚二酮、甲醇、乙酸、HFE 7100、锌盐都是提高显现效果的有效工作液成分，加热加湿是应用广泛的后处理方式。

国内关于茚二酮显现潜在手印的相关研究开展较晚，应用研究远多于对原理、优化、最佳显现条件的探究。尽管茚二酮已被澳大利亚、英国等列为渗透性客体潜在手印显现的第一顺位方法，其在国内的普及前景尚不明朗。气候环境条件对茚二酮的显现效果有较大影响，尚未有团队系统研究茚二酮在国内气候环境下的最佳配方条件、后处理条件；工作液处理后需要激发操作，基层单位多波段光源或激光器配置较少；都是茚二酮无法在国内现场勘查机构推广的原因。研发、优化出易于操作、保质期长、安全环保的茚二酮工作液配方，确定适用于国内环境的处理条件，是茚二酮显现技术未来应用于国内潜在手印显现的发展方向。