基于高效液相色谱法测定水中微囊藻毒素-LR的研究

李娜 陈文麟 黄成 何明穗

摘 要：利用全自动固相萃取仪—高效液相色谱的分析方法，采用甲醇+缓冲盐为流动相，分别测定水样和藻细胞中微囊藻毒素-LR，相关系数（R）0.999，加标回收率70%～119%。该方法测得的水质和藻细胞中微囊藻毒素-LR的回收率均满足监测要求，其中水中的微囊藻毒素-LR无需按照《生活饮用水标准检验方法 有机物指标》（GBT 5750.8-2006）方法进行回收率折算。实际样品的监测过程中发现水样中的MC-LR基本未检出，而藻细胞中的检出率较高，因此应高度关注藻细胞中MC-LR对河流环境质量的影响。

关键词：微囊藻毒素-LR;藻细胞;高效液相色谱;全自动固相萃取仪

中图分类号 X522 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2022）10-0139-03

Determination of Microcystin LR In Water by HPLC

LI Na   CHEN Wenlin   HUANG Cheng   HE Mingsui

（Guangdong North Guangdong Regional Ecological Environment Monitoring Center and Guangdong Shaoguan Ecological Environment Monitoring Center Station， Shaoguan 512026， China）

Abstract： MC-LR in water samples and algal cells was determined by Automated solid-phase extraction system-HPLC with methanol+buffer salt as mobile phase. The correlation coefficient（R） was 0.999 and the recovery ranged from 70% to 119%. The water quality measured by this method and the recovery rate of MC LR in algae cells are good. Among them， the recovery rate of MC LR in water does not need to be converted according to 《standard examination methods fordrinking water-organic parameters》 （GBT 5750.8-2006）， During the monitoring of actual samples， it is found that MC-LR in water samples is not detected， and the detection in algal cells is high. Great attention should be paid to the impact of MC-LR in algal cells on river environmental quality.

Key words： MC-LR; Algal cells; HPLC; Automated solid-phase extraction system

近年来，随着广东市主要河流相继出现水华现象，水华的治理与管控已成为管理部门重点关注的生态领域。水华现象（在海洋中称为“赤潮”）指伴随着浮游生物的骤然大量增殖而直接或间接发生的现象。构成水华现象的浮游生物种类很多，在淡水中藍藻占优势。研究表明：80%的蓝藻水华都可以检测出次生代谢产物—微囊藻毒素（microcystins，MCs），它对水体环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一。微囊藻毒素为七肽单环肝毒素，结构中存在着环状结构和间隔双键，因而具有相当的稳定性[1]。众所周知，微囊藻毒素存在多种同分异构体，但其中毒性最大、危害最广的是微囊藻毒素-LR，因此在《地表水环境质量标准》GB 3838-2002和《生活饮用水卫生标准》GB 5749-2006的限量标准中只对微囊藻毒素-LR进行了限制（均为0.001mg/L）[2-3]。本研究主要利用全自动固相萃取仪—高效液相色谱的分析方法，采用甲醇+缓冲盐为流动相[4]，分别测定水样和藻细胞中微囊藻毒素-LR，并对2种介质中微囊藻毒素-LR的稳定性和回收率进行评价。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 安捷伦1260高效液相色谱仪，配紫外检测器;全自动固相萃取仪，睿科，型号Fotector-08HT。微囊藻毒素-LR标液，农业部环境保护科研监测所;SB05-287-2012，20mg/L;磷酸盐缓冲溶液：用20%（体积分数磷酸（广州化学试剂厂，分析纯）溶液将磷酸二氢钾（广州化学试剂厂，分析纯）溶液）调至pH=3.0;淋洗溶液：10mL水;10mL 20%（体积分数）甲醇溶液等

1.2 水样采集 用采水器采集5～10L水样（水样采集后，在4h内完成以下前处理步骤），用500目的不锈钢筛过滤，除去水样中大部分浮游生物和悬浮物。取过滤后的水样5000mL于玻璃杯式滤器中，经滤膜减压过滤，准确量取1L滤液置于5个1L的棕色试剂瓶中。

1.3 试验方法

1.3.1 水样全自动固相萃取条件 经GF/F滤膜过滤后的5L水样按照表1固相萃取条件分5个上样位大体积上样，合并洗脱液浓缩至1mL，待测。

1.3.2 藻细胞测定方法 参考标准[5]，经过滤后的GF/C滤膜收集在100mL离心管中，在-30℃冷冻1h后拿出解冻，重复3次，冻融后的滤膜加入100mL 5%的乙酸水溶液超声萃取30min，重复3次，过滤后收集滤液，按照固相萃取条件富集净化，浓缩至1mL，待测。

1.3.3 液相色谱条件 色谱柱：C18反相柱，ODS（4.6×150mm）;柱箱温度：40℃;紫外可见光检测器波长：238nm;流速：0.8mL/min;流动相∶甲醇：磷酸盐缓冲溶液=59∶41。

2 结果与分析

采用外标法，以目标化合物的峰面积和浓度绘制标准曲线。线性相关系数R=0.999，微囊藻毒素-LR出峰时间10.7min，谱图见图1～3。

2.1 河流水样测定结果 2021年8—9月蓝藻暴发期间，取广东市代表性河流（长坝、孟洲坝以及白土大桥断面）进行空白水样、空白滤膜加标回收率及实际水样的实验室分析，结果见表2。由表2可以看出，经过连续3d对水体及滤膜中微囊藻毒素-LR浓度进行监测后发现，水样中的微囊藻毒素-LR全部未检出，而滤膜中的浓度较高，因此建议在地表水的監测过程中应高度注意滤膜介质微囊藻毒素-LR的检出情况。

2.2 实验室加标回收率 由表3可以看出，当取样量为5L时，测量得到的空白水样加标回收率在80%～119%，满足监测质控要求，而按照GB/T 5750.8-2006 13计算空白水样的加标回收率在133%～198%，均超过130%，回收率偏差较大，主要原因是由于在GB/T 5750.8-2006 13计算公式中加入了回收率计算系数0.6[5]，而随着分析技术的提高，特别是商品化的固相萃取小柱及自动化固相萃取仪的应用，大大提高了实际分析中水样的加标回收率，完全可以满足实际监测工作的需要，不需要对水样的回收率进行折算。但对于藻细胞样品，则需要对加标回收率进行折算，以期得到更为合理的实验数据。

3 结论

利用全自动固相萃取仪—高效液相色谱的分析方法，采用甲醇+缓冲盐为流动相，测定水样中微囊藻毒素-LR的浓度，相关系数0.999，加标回收率范围70%～119%。由空白水样的加标回收测试结果可以得出，利用全自动固相萃取仪—高效液相色谱的分析方法，采用甲醇+缓冲盐为流动相测得的微囊藻毒素-LR的含量完全满足质控要求，不需要进行回收率折算;但对于滤膜样品，则需要对加标回收率进行折算，以得到更为合理的实验数据。经过连续3d对水体及藻细胞中微囊藻毒素-LR浓度进行监测后发现，水样中的微囊藻毒素-LR全部未检出，而滤膜中的浓度较高，因此应高度关注藻细胞中微囊藻毒素-LR对河流环境质量的影响。

参考文献

[1]谢平.论蓝藻水华的发生机制——从生物进化、生物地球化学和生态学视点[M].北京：科学出版社，2008.

[2]GB3838-2002，地表水环境质量标准[S].北京：国家环境保护总局，2002.

[3]GB5749-2006，生活饮用水卫生标准[S].北京：中华人民共和国卫生部，2006.

[4]GB/T20466-2006，水中微囊藻毒素的测定[S].北京：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2007.

[5]GB/T5750.8-2006，生活饮用水标准检验方法有机物指标[S].北京：中华人民共和国卫生部，2007.

（责编：徐世红）