hsa_circ_0087378在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其对患者预后的影响

朱永刚，王明博，孟令娇，单保恩（河北医科大学第四医院.科研中心；.胸外科，河北 石家庄 050011）

食管癌是全球第七大常见的恶性肿瘤，也是全球癌症相关死亡的第六大原因[1]。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是中国人群食管癌的主要组织学类型[2]。尽管近年来关于ESCC 的治疗方案已有很大改进，但患者的5 年生存率仍不理想[3]。环状RNA（circular RNA，circRNA）是近年来发现的一类由共价键形成的闭合环状RNA[4-5]。由于缺乏Ploy A尾，circRNA与其相应的线性RNA相比具有高度稳定性[6-7]。越来越多的研究结果[8-12]表明，circRNA在人类细胞中广泛表达并参与包括肿瘤在内的许多疾病的发生发展。本课题分析了GEO 数据库中ESCC 和癌旁组织差异表达的circRNA，并采用qPCR 法在中国人ESCC 组织标本中进行验证，采用FISH 法在90 例ESCC 组织及癌旁组织中对筛选到的hsa_circ_0087378 进行检测，分析其表达与ESCC患者临床病理指标和预后的关系，为寻找ESCC的治疗靶点提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

10对经过病理验证的ESCC及癌旁组织新鲜标本取自2020年12月在河北医科大学第四医院行手术治疗的ESCC 患者；进行FISH 检测的组织样本取自于2015年10月至2016年4月在河北医科大学第四医院行手术治疗的90例ESCC患者。所有癌组织标本均经病理学检查证实为ESCC，且患者术前未行放疗、化疗。研究方案征得医院伦理委员会批准（2020ky357），入组患者或其家属均签署知情同意书。

1.2 qPCR法检测ESCC组织中hsa_circ_0087378的表达

采用TRIzol 试剂提取组织的总RNA，根据反转录试剂盒（购自Promega公司）说明书将提取的总RNA反转录为cDNA，然后使用GoTaq®qPCR Master Mix（购自Promega 公司）进行qPCR 检测，所用引物序列：U6上游为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；hsa_circ_0087378上游为5'-CTGTGGTGGTGATTGCGTCT-3',下游为5'-ATG TCATTCGCTGCAGTTCC-3'。qPCR反应条件：预变性95 ℃5 min；95 ℃15 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min。以U6为内参基因，采用2-△△CT法计算hsa_circ_0087378的相对表达量。

1.3 FISH法检测ESCC组织中has_circ_0087387的表达

组织切片经脱蜡入水后用PBS冲洗，加入预热的蛋白酶K溶液37 ℃处理20 min，PBS冲洗，加入封闭液37 ℃处理1 h，加入生物素标记的针对hsa_circ_0087378环化剪接点的特异性探针（序列为5'-TAATTT GGGTTTGCACCTTTCATGC-3'）在37 ℃下杂交过夜。次日，使用缓冲液洗脱非特异性结合位点，使用Cy5标记的链霉亲和素（ZyMAXTM Grade，Invitrogen公司）检测荧光信号。DAPI复染10 min，封片后采用LSM 900共聚焦显微镜（Zeiss公司）捕获图像。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件分析。符合正态分布的计量资料以表示，采用t检验分析circRNA 在组织中的表达情况。计数资料以率表示，采用卡方检验分析hsa_circ_0087378 的表达与临床病理学指标之间的关系。通过Kaplan-Meier 方法评估患者的总体生存率，通过Log-Rank检验比较各组之间的差异，以P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC组织中has_circ_0087378表达升高最为显著

从GEO数据库中查找ESCC及癌旁组织的circRNA芯片数据集GSE131969，以|log2(FC)|≥1 和P＜0.05为标准，共筛选得到602 个在ESCC 中上调的circRNA，89个下调的circRNA。图1A 为上调及下调倍数居高端的20个circRNA的差异表达图。选取10对ESCC组织及相应癌旁组织，采用qPCR法对数据库中筛查到的呈高上调前5 位的circRNA 进行验证，结果显示，hsa_circ_0087378、hsa_circ_0023984、hsa_circ_0000277、hsa_circ_0055038 在ESCC 组织中呈高表达，其中hsa_circ_0087378的表达水平最高（P＜0.01；图1B）。

图1 ESCC组织和相应癌旁组织中差异表达的circRNA

2.2 hsa_circ_0087378在ESCC组织中呈高表达

FISH检测结果（图2）显示，90例癌旁组织中，21例hsa_circ_0087378 呈高表达，高表达率为23.3%（21/95）；90 例ESCC 组织中，有65 例hsa_circ_0087378 呈高表达，高表达率为72.2%（65/95），结果表明，ESCC 组织中has_circ_0087387 表达水平明显高于癌旁组织（P＜0.05）。

图2 FISH法检测ESCC组织和癌旁组织中hsa_circ_0087378的表达

2.3 ESCC 组织中hsa_circ_0087378 表达与ESCC 患者临床指标的关系

分析ESCC 组织中has_circ_0087387 表达与患者临床指标的关系，结果（表1）显示，hsa_circ_0087378 的高表达与临床分期和淋巴结转移具有明显关联（均P＜0.05）。

表1 ESCC组织中hsa_circ_0087378表达与ESCC患者临床指标的关系

2.4 hsa_circ_0087378高表达的ESCC患者预后较差

生存分析结果（图3）显示，hsa_circ_0087378 高表达组的ESCC 患者5 年总生存率明显低于低表达组患者（P=0.005），提示hsa_circ_0087378 可能是ESCC患者预后不良的重要指标。

图3 hsa_circ_0087378的表达与ESCC患者5年总生存率的关系

3 讨论

近年来，越来越多的研究表明，circRNA 在食管癌的发展中起着至关重要的作用，有望成为食管癌早期诊断、预后判断的分子标志物及治疗靶点[13-16]。例如，hsa_circ_0000277 可以通过抑制miR-4766-5p的功能，从而上调层粘连蛋白α1（laminin alpha 1，LAMA1），促进ESCC 的进展[17]。circRNA has_circ_0006168 可通过调节miR-194-5p/JMJD1C 轴而增强ESCC 对紫杉醇的抗性[18]。hsa_circ_0000700 通过作为miR-1229 的分子海绵促进ESCC 细胞的增殖和迁移[19-20]。

本研究通过GEO 数据库分析了ESCC 组织和其相应癌旁组织中差异表达的circRNA，并以qPCR 法验证，结果发现hsa_circ_0087378、hsa_circ_0023984、hsa_circ_0000277、hsa_circ_0055038 在ESCC 组织中呈高表达，其中hsa_circ_0087378 表达水平最高。随后采用FISH法检测了hsa_circ_0087378在90例中国人ESCC组织及其相应的癌旁组织中的表达，发现其在ESCC 组织中的表达明显高于其相应的癌旁组织，并且其表达与ESCC 患者的临床分期及淋巴结转移具有明显关联。此外，生存分析结果表明，hsa_circ_0087378 的高表达与ESCC 患者的5 年总生存率较差有关联，其可作为ESCC患者预后不良的指标。以上结果表明，hsa_circ_0087378 可能在ESCC进展中发挥了促癌作用，推动了ESCC的发展进程。

综上，本研究为寻找ESCC的新型肿瘤生物标志物和潜在治疗靶点提供了实验依据。然而，hsa_circ_0087378在ESCC中发挥作用的具体分子机制仍不明确，需要今后深入研究。