miR-7在Oct4调节TLR4表达中的作用对结直肠癌细胞生长的影响

何劲松 段亮 谢育 魏寿江

摘要： 目的：探析微小核糖核酸（miR-7）在八聚物（Oct4）调节Toll样受体4（TLR4）表达中的作用对结直肠癌细胞生长的影响。方法：选择2020年1月-2021年12月，正常肠粘膜（对照组）、结直肠癌（观察组）临床样本中分别获得的17株和14株亚克隆细胞株。利用双荧光素酶报告系统结合免疫共沉淀技术，明确Oct4与miR-7、miR-7与TLR4分子层面的靶向调控关系;观察双向调控下结直肠癌细胞在体及细胞水平生物学功能，探讨Oct4-miR-7-TLR4信号通路的分子机制及功能调控作用。结果：观察组miR-7检测值低于对照组，Oct4、TLR4检测值、双阳性细胞、平均肿瘤球比高于对照组（P<0.05）;miR-7与Oct4、TLR4呈负相关，Oct4与TLR4呈正相关（P<0.05）。结论：Oct4高表达可导致miR-7表达下调，进而致TLR4表达上升，使结直肠癌患者出现miR-7低表达状态，Oct4、TLR4高表达状态，结直肠癌细胞生长、繁殖加快，肿瘤恶化程度加重。

关键词：结直肠癌;细胞生长;水平表达;分子机制;调控作用

【中图分类号】 R574.63 【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）13--02

[Abstract] Objective： To explore the effect of micrornas （Mir-7） on the growth of colorectal cancer cells by regulating toll-like receptor 4 （TLR4） expression by Oct4. Methods： From January 2020 to December 2021， 17 and 14 subclonal cell lines were selected from clinical samples of normal intestinal mucosa （control group） and colorectal cancer （observation group）， respectively. The dual luciferase reporting system combined with immunoprecipitation technique was used to clarify the targeted regulatory relationship between Oct4 and Mir-7， mir-7 and TLR4 at the molecular level. To observe the biological functions of colorectal cancer cells in vivo and at the cellular level under bidirectional regulation， and to explore the molecular mechanism and functional regulation of OCT4-Mir-7-TLR4 signaling pathway. Results： The detection value of Mir-7 in the observation group was lower than that in the control group， while the detection value of Oct4 and TLR4， double positive cells and average tumor ball ratio in the observation group were higher than those in the control group， with statistical significance （P<0.05）. The results showed that Mir-7 was negatively correlated with Oct4 and TLR4， while Oct4 was positively correlated with TLR4 （P<0.05）. Conclusion： High EXPRESSION of Oct4 can lead to down-regulation of Mir-7 expression， and then increase the expression of TLR4， resulting in low expression of Mir-7 in colorectal cancer patients. High expression of Oct4 and TLR4 can accelerate the growth and reproduction of colorectal cancer cells， and aggravate the degree of tumor deterioration.

結直肠癌是指源于大肠上皮细胞，发生在结肠或直肠部位的肿瘤疾病，以便血、排便习惯改变为典型临床表现，可伴尿频、腹痛、腹胀等症状，会对患者的正常生活、工作状态造成直接影响，且会危及其生命[1-2]。一般早期结直肠癌患者多无特异性临床表现，易漏诊、误诊，错失最佳诊疗时期[3]。近年来，随生物分子学相关研究地深入，靶向治疗已成为治疗癌症的新手段，成为国内外研究热点。八聚物（Oct4）是干细胞重编的关键因子之一，有抑癌基因和癌基因的双重作用，同肿瘤的发生、发展密切相关[4]。微小核糖核酸（miR-7）可通过调节多种靶基因的表达，抑制结直肠癌的发生、发展[5]。TOLL样受体家族（TLRs）TLR4在促进结肠黏膜上皮细胞的炎癌转化过程中发挥着重要作用，同结直肠癌的发生有相关性[6]。目前关于Oct4-miR-7-TLR4信号通路调控影响结直肠癌的研究尚少，所以本研究拟针对miR-7和TLR4在结直肠癌干细胞相关功能调节所发挥的作用，及Oct4调控结直肠癌干细胞致瘤能力的分子机制展开深入研究探析，以期为靶向结直肠癌干细胞的诊治提供新的方向和理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料

选择2020年1月-2021年12月，正常肠粘膜（对照组）、结直肠癌（观察组）临床样本中分别获得的17株和14株亚克隆细胞株。利用双荧光素酶报告系统结合免疫共沉淀技术，明确Oct4与miR-7、miR-7与TLR4分子层面的靶向调控关系;观察双向调控下结直肠癌细胞在体及细胞水平生物学功能，探讨Oct4-miR-7-TLR4信号通路的分子机制及功能调控作用。

1.2方法

1.2.1质粒构建、获得亚克隆细胞株

构建Oct4过表达、miR-7过表达及敲降、TLR4过表达及敲降质粒;构建含Oct4核心结合位点的miR-7启动子区域荧光素酶报告质粒;构建含miR-7靶点的TLR43’UTR荧光素酶报告质粒（均含有对照质粒）。后通过脂质体稳定转染法，获得结直肠癌细胞系SW620的亚克隆细胞株：Oct4过表达、miR-7过表达、Oct4过表达+miR-7过表达、Oct4过表达+TLR4敲降、TLR4敲降（均包括对照组亚克隆细胞株）。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）、免疫印迹（WB）等实验检测上述亚克隆细胞株中相关基因的表达。

1.2.2验证表达

在Oct4过表达细胞株及对照细胞株中转染具有Oct4核心结合位点（5’-CACCC-3’）的miR-7启动子序列的荧光素酶报告系统，检测其活性。采用染色质免疫共沉淀技术（CHIP）检测Oct4过表达细胞株及对照细胞株中Oct4与miR-7相关启动子区域的结合能力。在miR-7过表达细胞株及对照细胞株中转染具有miR-7核心结合位点的TLR43’UTR的荧光素酶报告系统及含突变位点的对照系统，检测其活性。在Oct4过表达+miR-7过表达及其对照细胞株中转染具有miR-7核心结合位点的TLR43’UTR的荧光素酶报告系统及含突变位点的对照系统，检测其活性。最后流式分选上述亚克隆细胞株中结直肠癌肿瘤干细胞（Lgr5+/EpCAM+，CSCs）及对照组（Lgr5-/EpCAM-，non-CSCs），检测细胞数目。检测Oct4/miR-7/TLR4通路对于结直肠癌肿瘤干细胞致瘤能力的影响将上述分选得到的CSCs及non-CSCs细胞亚群按照1个、10个、100个梯度的细胞数目在体外进行成球实验，在体内进行裸鼠皮下植瘤实验，检测结直肠癌肿瘤干细胞的致瘤能力。

1.2.3裸鼠移植瘤模型步骤

①取处于对数生长期的细胞，收集后用无血清培养基重悬，计数，稀释至浓度为8×107/ml的细胞悬液。②取适量的细胞悬液与Matrigel等比例混合，利用一次性无菌胰岛素注射器取100μ在裸鼠的双侧背部近大腿处进行皮下注射。③观察瘤子的生长情况，待移植瘤长出后，利用电子游标卡尺每周测量一次，记录肿瘤的长宽。根据公式π/6×长×宽2，计算肿瘤的大小。④待肿瘤大小至1，000mm3左右时（注射后30天左右），处死裸鼠，拍照，剥出皮下肿瘤，称重，按照次序排列整齐后拍照，绘制肿瘤生长曲线，对比两种细胞的生长能力。

1.2.4细胞数检测

双阳性细胞的数目。过程如下：①消化、离心、PBS重悬。②加抗体：Lgr5--PE，EpCAM--APC双标筛选结直肠癌干细胞，设空白对照，避光孵育20min。③孵育后每管加入500μl的完全培养基或PBS，1000r/min，离心5-7分钟，去上清，用含1%FBS，2%P/S的PBS500μl-1000μl重懸，进行上机检测，观察阳性细胞数量。根据将要接收细胞数目的多少，准备流式接管，分别收集双阳性细胞及双阴性细胞。

细胞成球实验过程如下：①细胞消化、离心、重悬、计数。②50μl完全培养基中1000个细胞与50ulmatrigel混合，这个过程在冰盒上操作。③上述100ul混合液铺于12孔板中。④放入37度温箱中，待半小时到一小时左右，凝固后，其上添加1ml完全培养基，防止胶体干掉。每隔两天换液一次。采用电子显微镜观察细胞的成球能力并拍照。

1.3 观察指标

①比较两组的miR-7、Oct4、TLR4表达。②miR-7、Oct4、TLR4在结直肠癌中的相关性。③比较两组的双阳性细胞和致瘤情况。

1.4 统计学方法

使用SPSS23.0软件对数据进行统计学分析，使用t和“x±s”表示计量资料，使用x2和%表示计数资料，相关性分析采用Pearson相关分析法。P<0.05表示数据差异有统计学意义。

2 结果

2.1比较两组的miR-7、Oct4、TLR4表达

观察组miR-7检测值低于对照组，Oct4、TLR4检测值高于对照组（P<0.05）。见表1。

2.2miR-7、Oct4、TLR4在结直肠癌中的相关性

结果显示，miR-7与Oct4、TLR4呈负相关，Oct4与TLR4呈正相关（P<0.05）。见表2。

2.3比较两组的双阳性细胞和致瘤情况

观察组双阳性细胞、平均肿瘤球比均高于对照组（P<0.05）。见表3。

3. 讨论

结直肠癌是较常见的一种胃肠道恶性肿瘤疾病，在肿瘤疾病中，结直肠癌发病率、病死率分别居于第三、第二[7]。流行病学显示，2018年全球结直肠癌新发病例达180万，死亡人数在88万左右，整体发病率、病死率较高[8]。且目前结直肠癌的具体病因尚未明确，难以给予有针对性的治疗措施。但随医疗技术的提升，近年发现结直肠癌发病是多种原癌基因与抑癌基因共同作用的结果，基于结直肠癌发病的分子机制，针对细胞信号通路寻找治疗靶点，行靶向治疗已成为国内外研究热点和难点。

肿瘤干细胞是肿瘤细胞存在的具有自我更新和致瘤特性，对传统放化疗存在抵抗的小部分细胞亚群，此部分细胞虽少，却是肿瘤发生、发展的关键。分析本研究结果数据。可能的原因如下：miR-7是多种肿瘤的抑癌基因，可作用于多种靶基因。在肿瘤疾病中，miR-7呈高表达状态，有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和细胞周期进程的作用，对促进肿瘤细胞凋亡，控制病情有积极影响。本研究中，结直肠癌者的miR-7呈低表达状态，可侧面说明miR-7表达下降，致肿瘤细胞增殖、生长得不到有效控制，患者病情开始逐渐恶化。Oct4有抑癌基因和癌基因双重作用，亦是维持胚胎干细胞多能性及自我更新能力的主要调节剂。Oct4表达上升，可能会促进肿瘤细胞的增殖分化，可能会通过调节PI3K/Akt通路，达维持肿瘤干细胞增殖、分化能力，加重结直肠癌病情的目的。TLR4在促进结肠黏膜上皮细胞的炎癌转化过程中发挥着重要作用，可通过调控下游NF-κB等多种基因的表达，来促进结直肠癌的发生[9]。即TLR4通过促进炎性因子分泌，加重胃肠道炎症反应，使肿瘤细胞对细胞毒性T淋巴细胞的攻击产生抵抗，进而促进肿瘤细胞的生长、繁殖，加重肿瘤恶化程度[10]。就Oct4-miR-7-TLR4信号通路的分子机制而言，本研究中，结直肠癌者的miR-7呈低表达，Oct4、TLR4呈高表达，说明Oct4过表达可导致miR-7表达下调，随miR-7表达下降，结直肠癌失去保护因素，TLR4等危险因素呈上升趋势。miR-7表达越低，Oct4、TLR4表达越高，结直肠癌干细胞的致瘤能力越强，患结直肠癌的风险越高，肿瘤病变程度越严重。

综上所述，Oct4高表达可导致miR-7表达下调，进而致TLR4表达上升，使结直肠癌患者出现miR-7低表达状态，Oct4、TLR4高表达状态，结直肠癌细胞生长、繁殖加快，肿瘤恶化程度加重。

参考文献：

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[4] 程玉，赵醒，次云哲，等.干细胞转录因子OCT4在结直肠癌组织中的表达及其意义[J].临床与实验病理学杂志，2018，34（1）：86-88.

[5] 薛迪新，吴伟力，陈积贤，等.环状RNA Cdr1as/miR-7/SP1轴调控乳腺癌细胞侵袭和转移的研究[J].浙江医学，2021，43（20）：2162-2168.

[6] 闫晓菲，赵广越，乔鋆，等.miR-30c-5p及Toll样受体4在结肠癌中的表达及意义[J].中国综合临床，2021，37（1）：57-61.

[7] 王德征，张爽，张辉，等.天津市结直肠癌死亡率1999—2015年变化趋势分析[J].中华胃肠外科杂志，2019，22（6）：579-586.

[8] 郑莹，王泽洲.全球结直肠癌流行数据解读[J].中华流行病学杂志，2021，42（1）：149-152.

[9] 张晓红，南琼.MicroRNA-7在结直肠癌中的研究进展[J].胃肠病学，2019，24（7）：444-446.

[10] 李昂，仵红娇，谢俞宁，等.Toll样受体基因组特征与直肠癌临床病理及免疫参数的相关性分析[J].解放军医学杂志，2021，46（4）：340-347.

基金项目：南充市市校科技战略合作专项资金（20SXQT0151）

作者简介：何劲松（1985，12）男，硕士，四川南充人，汉族，主治醫师，研究方向：胃肠道肿瘤基础与临床、减重代谢性疾病的外科治疗。

通讯作者：魏寿江（1966，10）男，硕士，重庆人，汉族，教授、科室主任，研究方向：胃肠道肿瘤基础与临床。