关节克痹丸质量标准研究

孙乐明 赵君 陈芝慧 王文渊

摘要：目的建立关节克痹丸定性定量检测方法，为其质量标准提高提供依据。方法采用薄层色谱法，对制剂中麻黄和虎杖进行定性鉴别。通过高效液相色谱法测定了有效成分大黄素的含量。结果 TLC鉴别方法专属性好，斑点清晰且分离度好;HPLC含量测定结果显示，大黄素在12.217μg～28.507μg/mL，线性关系良好。仪器精密度、重复性、稳定性、加样回收率的RSD值均符合要求。结论所建立的方法操作简单，重复性较好，可用于关节克痹丸的质量控制研究。

关键词：关节克痹丸;质量标准;薄层色谱法;高效液相色谱法

【中图分类号】 R322.7+2 【文献标识码】 A      【文章編号】2107-2306（2022）13--02

关节克痹丸的标准收载于卫生部部颁标准中成药成方制剂第二十册，为浓缩丸剂，主要成份由川乌（制）、虎杖、麻黄等15味中药组成。具有祛风散寒、活络止痛的功效，用于关节炎、四肢酸痛、伸展不利[1]。方中川乌（制）、草乌（制）等为主药，起祛风止痛之效，配以防已、独活等除湿止痛，配以桂枝、麻黄等温阳利水化气，再佐以黄芩等清热并防止诸药过于温燥，全方配伍适宜，具有消除关节肿痛，调节免疫平衡，恢复关节功能等作用。其临床使用有效、安全，不良反应极少且较轻[2]。原标准为卫生部98年标准，其内容只有1项粉末鉴别和1项麻黄的TLC鉴别以及丸剂常规检查项目，难以有效的控制药品质量。本次药品标准提高研究，通过对原标准符合基础上，重新对本品的性状、鉴别、检查以及含量测定进行了全面研究，并根据研究结果重新制订了关节克痹丸药品质量标准（草案）。增加了虎杖的TLC鉴别，并通过方法学研究，建立了有效成分大黄素的含量测定方法，以进一步提高该药的质量控制水平。

1. 材料与仪器

薄层板1：硅胶G薄层板（薄层板，规格：100×200mm，）;薄层板2：自制硅胶G薄层板（固定相：硅胶G，粘合剂：0.5%的CMC-Na，涂布厚度：0.3mm，规格：100×200mm）; MS304s/01电子天平;P-1型薄层色谱展开缸;5μL点样毛细管;SLD-1薄层色谱摄影仪;Waters2690高效液相色谱仪，waters2489双波长紫外检测器。

关节克痹丸（20151201，20151202，20151203，贵州信邦制药股份有限公司）;盐酸麻黄碱对照品，中国药品生物制品检定所，批号为0714-9903;大黄素对照品，中国食品药品检定研究院，批号为110756-200110。甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2.方法与结果

2.1虎杖的TCL鉴别[3]

取3批本品各10粒，研碎，加甲醇10mL，超声处理15min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使其溶解，作为供试品溶液。取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取对照品溶液5μL，供试品溶液各10μL。分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15：5：1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，置于氨蒸气中熏后，斑点变为红色。

2.2方法学验证

2.2.1专属性考察

吸取对照品溶液5μL，供试品溶液各10μL。点样于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置于紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，置于氨蒸气中熏后，斑点变为红色。表明该方法的专属性良好。

2.2.2耐用性考察

（1）更换不同品牌薄层板

吸取对照品溶液5μL，供试品溶液各10μL。点样，更换不同品牌的薄层板（薄层板1、薄层板2），展开，取出，晾干，置于紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色，且更换不同品牌薄层板后，各薄层板之间无显著差异，表明更换不同品牌薄层板对虎杖的薄层鉴别无影响。

（2）更换不同温度

吸取对照品溶液5μL，供试品溶液各10μL。点样于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置于紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色，且更换不同温度后，各薄层板之间无显著差异，表明更换不同温度对虎杖的薄层鉴别无影响。

（3）更换不同湿度

吸取对照品溶液5μL，供试品溶液各10μL。点样于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置于紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色，且更换不同湿度后，各薄层板之间无显著差异，表明更换不同湿度对虎杖的薄层鉴别无影响。

2.3大黄素的含量测定[4-5]

2.3.1色谱条件

Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温35℃，甲醇-0.1%磷酸水（80：20）为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长254nm。

2.3.2系统适用性试验

吸取对照品溶液20μL注入高效液相色谱仪测定，理论板数按大黄素计算大于4000。

2.3.3溶剂制备

对照品溶液的制备：精密称取大黄素对照品适量，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取粉末1g，精密称定，置烧瓶中，加三氯甲烷30ml和2.5mol/L硫酸20mL，置80℃水浴中加热回流2h，冷却至室温，摇匀。分取三氯甲烷液，水层用三氯甲烷20mL振摇提取，合并三氯甲烷液，回收溶液至干，残渣加甲醇适量使溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

阴性制剂溶液的制备：取去除虎杖的阴性制剂，同供试品溶液的方法制备，即得。

2.3.4方法学考察

（1）空白试验

取阴性制剂溶液20μL注入高效液相色谱仪测定，结果表明，在大黄素峰处基本无干扰。

（2）标准曲线及线性范围

取大黄素适量，精密称定，制成81.45μg/mL的标准贮备液，再精密吸取上述对照品溶液1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL，用甲醇定容至10mL，分别吸取20μL对照品溶液注入液相色谱仪测定。结果见表-1。

经回归分析，得回归方程：A=74085C+57076，相关系数r=0.9991，线性范围12.217～28.507μg/mL。

（3）精密度试验

吸取浓度为20.362μg/mL的对照品溶液20μL注入高效液相色谱仪测定，连续6次，结果见表-2。

（4）重复性试验

配置供试品溶液（批号）共6份，分别吸取20μL溶液注入液相色谱仪测定，结果见表-3。

（5）加样回收率试验

取批号关节克痹丸，研碎的粉末约0.5g，精密称定，共6份，精密加入81.45μg/mL大黄素对照品溶液3.1mL，混匀后，其他处理同含量测定。分别吸取20μL溶液注入液相色谱仪测定，结果见表-4。

（6）供试品稳定性试验

取供试品溶液，于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h精密吸取20μL注入高效液相色谱仪，测定样品12h的稳定性。结果表明，供试品在12h内稳定，见表-5。

（7）样品含量测定

分别精密吸取20μL注入高效液相色谱仪测定，结果如表-6所示。

3. 结论

质量标准是中药研究的重要内容之一，需要在中药的处方组成、制备工艺和药效物质等基础上，运用现代科学技术，建立科学、合理、可行的质量标准，从而保障药品的质量可控[6]。因此，本实验对关节克痹丸中虎杖进行薄层鉴别，对有效成分大黄素的含量进行测定，制定关节克痹丸的质量标准，提高其质量控制水平，保证药品的安全性和有效性。结果表明该方法操作简单，结果准确，专属性强，稳定性和重复性均较好，为关节克痹丸质量标准的提高提供依据。

参考文献：

[1]中华人民共和国药典委员会.卫生部药品标准.中药成方制剂，第20册 [S].1998：87.

[2]殷生楠，殷勇，柳冬梅，等. 关节克痹丸的有效性和安全性临床研究[J]. 现代医药卫生，2007，23（21）：3176-3177. 67-2272.

[3]貴州信邦制药股份有限公司. 关节克痹丸中虎杖的鉴别方法：CN201610752418.7[P]. 2017-02-01. 75.

[4]施惠埙. 高效液相色谱法测定关节克痹丸中大黄素含量[J]. 实用中医药杂志，2010，26（11）：807.

[5]周红，俞春芳，王金锋. HPLC法测定关节克痹丸中大黄素含量[J]. 中国药师，2007，10（5）：474-4.

[6]郭静，玄振玉，谢燕.中药复方新药药学研究中的问题与思考[J].中草药，2020，51（08）：22.

作者简介：孙乐明（1984-），男，硕士，助理研究员，研究方向为中药材栽培与开发。