不同浓度丙泊酚麻醉孕中期大鼠对雄性子代学习和记忆功能的影响及其机制▲

梅 静 喇宏玲 徐桂萍

(新疆维吾尔自治区人民医院麻醉科,乌鲁木齐市 830001，电子邮箱：my7future7@163.com)

人类神经发育过程中接触麻醉剂会导致神经变性和长期神经行为异常，例如学习障碍和记忆障碍等[1]。孕中期是神经发生和神经元迁移的时期，在此期间胎儿对外部环境十分敏感。而随着腹腔镜手术和胎儿手术的迅速发展，越来越多的孕妇在怀孕期间，特别是在孕中期进行手术。因此，麻醉剂对胎儿出生前神经发育的影响受到越来越多学者的关注。已有研究表明，丙泊酚可能对子代长期行为产生影响，但其结论仍然存在很大的争议[2-3]。因此，需要进一步研究丙泊酚对孕中期胎儿神经发育的影响及其机制。研究证实，钙离子-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)的磷酸化或激活，可激活环磷酸腺苷效应元件结合蛋白(cyclic AMP responsive element binding protein,CREB)从而影响个体的学习和空间记忆，对海马区的记忆功能巩固发挥着关键作用[4-5]。但目前关于丙泊酚麻醉孕中期大鼠对子代海马组织中CaMKⅡ/CREB信号通路的影响的研究较少。因此，本研究探讨丙泊酚麻醉孕中期大鼠对子代学习和记忆缺陷的影响，并观察CaMKⅡ/CREB信号通路在其中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物、试剂与耗材 72只8周龄成年无特定病原体级SD雌性大鼠和24只雄性大鼠购于新疆维吾尔自治区实验动物研究中心[生产许可证号为SYXK(新)2016-0001，质量合格证号为NO.65000200000364]。生长相关蛋白43(growth-associated protein 43,GAP43；批号：ab75810)、突触后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95；批号：ab238135)、B细胞淋巴瘤蛋白-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2；批号：ab182858)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax；批号：ab32503)、Caspase3(批号：ab32351)、Cleaved-caspase3(批号：ab32042)、CaMKⅡ(批号：ab181052)、CREB(批号：ab32515)、磷酸化CREB(phosphorylated-3-CREB,p-CREB；批号：ab32096)和内参蛋白GAPDH(批号：ab9485)一抗和二抗(批号：ab6721)均购于美国Abcam公司；视频跟踪系统购于上海移动数据有限公司(型号：XR-XM101)；丙泊酚购于美国Sigma Aldrich公司(批号：2078-54-8)，KN-93磷酸盐购于美国Selleck化学公司(批号：S7423)，尼氏染色试剂盒购于上海碧云天公司(批号：C0117)，戊巴比妥钠(分析纯)购于德国默克公司(批号：20160411)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物饲养环境：成年SD大鼠饲养于在(24±1)℃的环境中，光照/黑暗周期为12 h/12 h，动物自由摄食和饮水。所有实验程序和实验方案均获得我院实验动物伦理委员会批准[文号PHXUAR-LL-2020-0453-R]，并按照美国国立卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》[6]的原则，使所用动物的总数及动物的痛苦最小化。

1.2.2 孕鼠的麻醉剂暴露和剖腹探查术：将3只雌鼠与1只雄鼠关于一笼中(共24笼)，进行自由交配。第2天通过目测观察每只雌鼠的阴道栓子联合阴道涂片检测来判断是否存在精子，如存在则认为受孕成功，并定义为孕0 d，由此推算并选择孕期为14 d的母鼠进行实验(本研究中每只雌鼠均检测到精子并存在阴道栓子)。于自制透明塑料瓶中固定孕期为14 d的72只雌性大鼠，采用腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉，行颈内静脉穿刺放置静脉导管。使用随机数字表法将雌鼠分为4组，每组18只，其中对照组(C组)经颈内静脉注射2 mL/kg生理盐水后不做任何处理；丙泊酚低剂量组(L组)经颈内静脉注射1.0%的丙泊酚2 mL/kg行麻醉诱导，然后以20 mg/(kg·h)的速度持续静脉泵注1.0%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手术，麻醉时间4 h；丙泊酚中剂量组(M组)经颈内静脉注射1.5%的丙泊酚2 mL/kg进行麻醉诱导，然后以20 mg/(kg·h)的速度持续静脉泵注1.5%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手术，麻醉时间4 h；丙泊酚高剂量组(H组)经颈内静脉注射2.0%的丙泊酚2 mL/kg行麻醉诱导，然后以20 mg/(kg·h)的速度持续静脉泵注2.0%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手术，麻醉时间4 h。

1.2.3 剖腹探查术：以翻正反射消失作为动物麻醉诱导成功的标准。成功麻醉诱导后剪去L组、M组、H组大鼠的腹毛，对露出的皮肤使用75%无菌酒精消毒3遍，使用0.125%丁哌卡因(0.2 mL/只)进行局部麻醉，于腹部正中做一长约3 cm的纵向切口。无菌探查腹腔范围包括膈肌(肝脏)、盆腔、膀胱、两侧腹中线水平(脾脏或肾)；随后用2 mL的37℃无菌生理盐水冲洗腹腔，吸净液体，用75%酒精消毒切口。采用4-0缝线间断缝合腹膜和肌层，采用3-0缝线间断缝合皮肤并消毒，擦干切口血渍。在25 min内完成手术。大鼠苏醒后放回原笼，继续妊娠。

1.2.4 围术期监测：麻醉各组动物后，采用RM6240生理信号采集处理系统、血压计、血气分析仪分别监测其心电图、血压、血氧饱和度，麻醉结束后立即从母鼠髂外静脉取血进行血气分析。麻醉期间监测孕鼠血氧饱和度、血压、心率，剔除血氧饱和度<95%或平均动脉压超出/低于基础值20%的孕鼠。从上述4组中每组随机选12只血氧饱和度、血压、心率正常的孕中期大鼠，进行后续实验。

1.2.5 收集生殖发育参数：统计上述的48只孕鼠的妊娠时长，即从孕0 d开始到子代出生，以及子代大鼠的性别比例、数量和体重。

1.2.6 检测子代的学习记忆功能：子鼠出生后30 d，从各组母鼠所产的所有雄性子代中按随机数字表法选择30只，进行学习和空间记忆检测(为排除发情周期对啮齿动物行为的影响，仅对雄性子代进行了行为测试)。采用Morris水迷宫系统(美国CoulBOURN公司)检测大鼠的学习记忆功能。将Morris水迷宫系统(直径1.6 m、深0.6 m，第Ⅱ象限中有可移动的圆柱形平台直径0.15 m)置于固定的测试间内，每日8：00开始测试，水温(23±1)℃，第Ⅱ象限的平台在水下1 cm，每日训练1次。第1～5天(出生后30～34 d)观察大鼠的定位航行能力，即从离平台最远的第Ⅲ象限选择一固定入水点将大鼠背对平台放入水中；若90 s内大鼠找到平台，则将其留在平台上20 s，若90 s内未能找到，将其引上平台同样停留20 s。记录大鼠寻找到平台的时间，即为逃避潜伏期，若90 s内未找到平台，按90 s计算。第6天(出生后35 d)行空间探索实验，撤去水中平台，于固定的进入点将大鼠放入水中，记录90 s内在第Ⅱ象限停留时间及穿越原平台次数。每次试验后，干燥大鼠毛发并用热灯温暖5 min，然后再放回常规笼。取所测雄性子代的平均值作为最终测定结果。

1.2.7 抑制剂注射和学习、空间记忆测试：由于实验结果显示M组和H组剂量丙泊酚对子代学习记忆缺失的影响高于L组，且H组与M组子代学习记忆缺失的影响无明显差异，因此选择M组子代用于机制研究。于M组的雄性子代出生后36 d(测试完成后1 d)随机选取6只，腹腔注射CaMKⅡ的特异性抑制剂KN-93磷酸盐0.5 mg/kg，用生理盐水溶解至2.5 mL，1次/d，持续 7 d (出生后36～42 d)，作为M+KN-93组。另取出生后36 d的M组雄性子代大鼠作为对照，腹腔注射2.5 mL生理盐水(1次/d，持续7 d)，作为M+saline组。于出生后43～48 d使用Morris水迷宫法检测大鼠子代的学习记忆能力。

1.2.8 Western blot分析：在C组、L组、M组、H组、M+KN-93组及M+saline组的子代大鼠完成最后一次Morris水迷宫测试后，采用随机数字表法在每组选择3只子代大鼠,断头法处死后分离脑海马组织。海马组织匀浆后用RIPA裂解缓冲液提取海马组织总蛋白，用于测定GAP43、PSD95、凋亡标志物(Bcl-2、Bax、Caspase3、Cleaved-Caspase3、CaMKⅡ，CREB、p-CREB、GAP43、PSD95的表达。经过SDS-PAGE分离并随后转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜与Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶500)、Caspase3(1 ∶500)、Cleaved-Caspase3( 1 ∶1 000)、CaMKⅡ(1 ∶1 000)、CREB(1 ∶600)、p-CREB(1 ∶800)、GAP43(1 ∶1 000)、PSD95(1 ∶500)和GAPDH(1 ∶1 000)的一抗4℃孵育过夜，用1×Western Wash Buffer洗涤3次，每次5 min。洗涤后用辣根过氧化物酶结合的免疫球蛋白G抗体(二抗)孵育1 h，用1×Western Wash Buffer洗涤3次，每次5 min。通过增强化学发光法使蛋白条带显色，使用Amersham Biosciences ECL检测系统扫描蛋白条带，并通过ImageJ软件进行定量，实验重复3次。

1.2.9 尼氏染色观察神经元的密度：选择M+KN-93组及M+saline组的出生后48 d的子代大鼠各3只，经断头法处死，先后用生理盐水和4%多聚甲醛经心脏灌流，然后取出脑组织，并在4℃下于4%多聚甲醛中固定过夜。石蜡包埋后，距前囟3.3 mm处行冠状切片(厚4 μm)，并行尼氏染色。使用数字显微镜照相机(德国徕卡公司)捕获CA1区域的锥体细胞层的代表性显微照片。每只大鼠计算3张尼氏染色切片的细胞图像。由两名工作人员使用ImageJ软件以盲法对尼氏染色阳性神经元细胞进行计数。实验重复3次。神经元密度=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间采用t检验或单因素方差分析(采用LSD-t进行多重比较)。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 孕中期不同浓度丙泊酚暴露对雌鼠生殖结局和子代体格发育参数的影响 4组雌鼠的妊娠时长、每只雌鼠产仔数、子代雄雌比、雄性子代体重比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 4组雌鼠生殖结局和子代发育参数的比较(x±s)

2.2 孕中期不同浓度丙泊酚暴露对子代学习记忆能力的影响 与C组相比，L组、M组、H组大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潜伏时长均增加，平台穿越次数均减少，第Ⅰ象限的停留时间均延长，而第Ⅱ象限的停留时长均缩短(均P<0.05)；与L组大鼠雄性子代相比，M组和H组大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潜伏时长均增加，平台穿越次数均减少，第Ⅱ象限的停留时长均缩短(均P<0.05)；而M组和H组大鼠雄性子代上述指标差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 4组大鼠雄性子代Morris水迷宫系统检测指标的比较(x±s)

组别n平台穿越次数(次)各象限停留时间(s)ⅠⅡⅢⅣC组305.724±0.9729.213±1.45343.561±6.98827.536±4.03511.545±2.164L组303.584±0.671a18.891±3.094a32.564±3.162a26.563±4.31412.191±2.971 M组302.474±0.433ab17.244±2.552a19.672±2.711ab26.644±1.66012.094±2.385 H组302.094±0.213ab17.012±1.231a15.694±1.302ab27.941±2.32113.172±2.562 F值176.11682.652225.14521.55217.632P值0.0110.0310.0090.0620.115

2.3 孕中期不同浓度丙泊酚暴露对子代海马区凋亡相关蛋白表达的影响 与C组相比，L组、M组、H组大鼠雄性子代海马区的Bax、Cleaved-Caspase3表达量均上调， Bcl-2、GAP43、PSD95表达量均下调(均P<0.05)；与L组比， M组、H组大鼠雄性子代海马区的Bax、Cleave-Caspase3表达量均上调，Bcl-2、GAP43、PSD95表达量均下调(均P<0.05)；而4组大鼠雄性子代海马区的Caspase3表达量，以及M组与H组上述蛋白表达量比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图1、表3。

图1 4组凋亡相关蛋白电泳条带图

表3 4组大鼠雄性子代海马区凋亡相关蛋白相对表达量的比较(x±s)

2.4 孕中期不同浓度丙泊酚暴露对子代海马组织CaMKⅡ/CREB信号通路激活的影响 与C组相比，L组、M组、H组大鼠雄性子代海马组织的CaMKⅡ蛋白表达量均上调，p-CREB蛋白表达量均下调；与L组相比，M组、H组大鼠雄性子代海马区的CaMKⅡ蛋白表达量均上调，p-CREB蛋白表达量均下调(均P<0.05)；而4组大鼠雄性子代海马区的CREB蛋白表达量，以及M组与H组上述蛋白表达量比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图2、表4。

图2 4组CaMKⅡ/CREB信号通路蛋白电泳图

表4 4组大鼠雄性子代海马区CaMKⅡ、CREB、p-CREB蛋白相对表达量的比较(x±s)

2.5 KN-93磷酸盐对大鼠雄性子代学习记忆能力的改善作用 在出生后48 d，与M+saline组相比，M+KN-93组大鼠雄性子代的逃避潜伏期变短，平台穿越次数增加，第Ⅱ象限停留时间延长，海马组织中CaMKⅡ蛋白表达量下调，p-CREB、GAP43、PSD95蛋白表达量上调，神经元细胞密度增加(均P<0.05)。见表5～6和图3～4。

表5 两组大鼠雄性子代Morris水迷宫测试结果的比较(x±s)

表6 两组大鼠海马区相关蛋白相对表达量和神经元细胞相对密度的比较(x±s)

图3 两组雄性子代海马区尼氏染色结果(×200)

图4 两组大鼠海马区相关蛋白电泳图

3 讨 论

尽管既往已有研究证实在胎儿期接触丙泊酚对其长期神经发育结局的影响，但研究结果仍存在争议[7-8]。有研究表明， 2.5%丙泊酚单次暴露2 h可损害子代小鼠的学习和记忆功能[9]。然而，另一项类似的研究表明，怀孕小鼠接触丙泊酚不会导致子代小鼠出现学习行为异常[10]。上述研究之间的差异可能与物种、麻醉方案的差异(确切孕龄、麻醉剂类型、剂量、暴露时间等)或行为测试的敏感性有关。本研究采用孕14 d的大鼠进行实验，此阶段被认为与人类妊娠的孕中期相似[11]。本研究中孕中期大鼠丙泊酚的暴露方式为：经颈内静脉注射(1.0%、1.5%、2.0%)2 mL/kg丙泊酚进行麻醉诱导，然后以 20 mg/(kg·h)的速度持续静脉泵注丙泊酚，并行剖腹探查手术，麻醉时间为 4 h，该时间长度与临床真实情况更类似。然而在一些临床手术中，为了放松子宫平滑肌并为胎儿干预提供足够的麻醉，胎儿脑部可能会遭受到浓度更高的麻醉剂造成的损害[12]。因此，本研究观察不同浓度(1.0%、1.5%、2.0%)的丙泊酚麻醉对大鼠子代学习记忆的影响。本研究结果显示，C组、L组、M组、H组雌性大鼠的妊娠期、每只雌鼠产仔数、子代雄雌比、雄性子代体重比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，说明孕中期接触丙泊酚未对雌性大鼠生殖结局和雄性子代体格发育造成影响。本研究的Morris水迷宫测试结果表明，与C组大鼠雄性子代相比，L组、M组、H组大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潜伏时长均增加，平台穿越次数均减少，第Ⅰ象限的停留时间均延长、第Ⅱ象限的停留时长均缩短(均P<0.05)；与L组大鼠雄性子代相比，M组和H组大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潜伏时长均增加，平台穿越次数均减少，第Ⅱ象限的停留时长均缩短(均P<0.05)；而M组和H组大鼠雄性子代上述指标比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。这说明孕中期大鼠接触低、中、高浓度的丙泊酚均能引起雄性子代的学习和记忆能力部分缺失，且中、高浓度丙泊酚的作用更明显。

研究表明，CaMKⅡ的磷酸化或激活对海马区的记忆的巩固发挥着关键作用[13]，而且海马CaMKⅡ/CREB信号通路在药物诱导学习记忆功能衰退中具有重要意义。已有研究证实CaMKⅡ/CREB信号通路介导了重金属诱导动物的学习记忆能力衰退，其中海马区CaMKⅡ激活受到抑制和CREB激活(CREB磷酸化)增加是改善认知功能障碍的关键[14]。本研究结果显示，不同浓度丙泊酚麻醉孕中期大鼠后，其雄性子代的学习记忆能力明显降低。Caspase3经过切割、活化之后会变成Cleaved-Caspase3，而后者是高活性的细胞凋亡激活酶，本研究结果显示，各丙泊酚干预组中海马区Cleaved-Caspase3表达量增加，同时凋亡标志物Bax蛋白表达量也增加，而且凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达量降低(均P<0.05)，这表明丙泊酚对海马神经元可能有促凋亡的作用。进一步研究发现，各丙泊酚干预组中大鼠雄性子代大脑海马区CaMKⅡ的激活增加以及CREB的激活减少，表现为CaMKⅡ的磷酸化水平上调，而CREB的磷酸化受到抑制，而且中、高浓度丙泊酚的作用更明显；使用CaMKⅡ抑制剂抑制其激活时，伴随着海马区CREB激活的增加，子代大鼠的学习记忆能力明显恢复。这些结果表明丙泊酚麻醉孕中期大鼠可通过激活CaMKⅡ/CREB信号通路影响雄性子代的学习、记忆能力。另外，本研究结果显示，不同浓度的丙泊酚麻醉孕中期大鼠可降低其雄性子代海马区突触可塑性相关蛋白PSD95和GAP43的表达量，而有趣的是，当使用CaMKⅡ抑制剂抑制其激活后，大鼠雄性子代海马组织的神经元细胞密度增加，而且海马区PSD95和GAP43蛋白的表达量均上调。这表明海马区的神经元数目及PSD95、GAP43表达可能受到CaMKⅡ/CREB信号通路调节。有学者发现，CaMKⅡ/CREB信号通路在海马神经元保护和突触可塑性中的主导作用[15]。

本研究存在几个局限性：首先，由于为了减少实验中处死动物的数量，本研究仅选择中剂量丙泊酚组(M组)大鼠的子代作为机制研究，所得结果可能会有偏倚；其次，为避免子代大鼠受发情期的影响，本研究中仅选用大鼠雄性子代作为研究对象，丙泊酚对于大鼠雌性子代的影响仍需进一步研究。

综上所述，使用不同浓度的丙泊酚麻醉孕中期大鼠均会导致雄性子代的学习、记忆功能下降，并伴有海马组织CaMKⅡ蛋白表达上调及CREB激活程度降低，抑制CaMKⅡ表达可提高大鼠雄性子代的学习、记忆功能，其作用机制可能与CREB激活有关，CaMKⅡ/CREB信号通路可能是治疗孕中期丙泊酚暴露致子代学习、记忆能力缺失的关键靶点。