芹菜素黄酮氧苷、黄酮碳苷同分异构体抗炎活性评价

李 慧，潘思轶，徐晓云,

（1.江汉大学生命科学学院，湖北武汉 430056；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430070）

黄酮类化合物广泛存在于蔬菜、水果等植物性食品原料中。自然界存在的黄酮类化合物多以黄酮苷的形式存在，即黄酮苷元与糖类结合形成了糖苷键，据此黄酮类化合物可分为黄酮氧苷和黄酮碳苷：黄酮苷元上氧原子与糖链以C-O 链接形成黄酮-O-糖苷；黄酮苷元上碳原子与糖链以C-C 链接形成黄酮-C-糖苷[1]。在黄酮类化合物中，黄酮氧苷较黄酮碳苷类化合物常见，例如芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖即大波斯菊苷[2−3]及5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元等。而随着质谱等鉴别技术的发展，近年来越来越多的黄酮碳苷被发现，黄酮碳苷的C-糖苷取代常发生在黄酮苷元母核结构的C6 位或C8 位，如牡荆素和异牡荆素是芹菜素-C-糖苷同分异构体，夏佛塔苷、异夏佛塔苷是葡萄糖和阿拉伯糖两种不同的糖基配体与芹菜素苷元形成的芹菜素6，8-双-C-糖苷同分异构体[4]。黄酮类化合物一般具有较低的毒性和广泛的生物活性。

芹菜素黄酮苷元可以通过抑制NF-κB 信号通路发挥抗炎活性[5−6]，其形成的芹菜素黄酮苷也显示出较好的抗炎作用。芹菜素黄酮碳苷天然存在于清热解毒的植物性材料中，如箬叶[7]、三叶青[8]、绿豆衣[9]、莲子心[4]，基于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激建立小鼠巨噬细胞RAW264.7 炎性细胞模型发现此类植物提取物具有炎性抑制作用[9−10]。除此之外，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷可通过抑制炎性和氧化应激反应减轻LPS 诱导的急性中耳炎[11]。然而关于5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元是否具有抗炎活性尚不明确，芹菜素形成的几种O-糖苷、C-糖苷同分异构体的活性差异亦尚未见报道。动物模型是常用的体内活性评价模型，但动物模型实验样品量消耗大，无法针对重要作用靶点进行单一信号通路的研究与确认，因此单一的细胞系模型更有助于评价黄酮类化合物的抗炎活性及作用机制。

THP-1 是人髓系白血病单核细胞，具有与原代单核细胞相似的表型和功能特征，以及稳定的遗传能力[12−13]。LPS 刺激佛波酯（phorbol 12-myristate13-acetate，PMA）分化的THP-1 细胞是常用的人源性炎性细胞模型，以之建立模型，可以有效评价活性成分的抗炎作用，并分析其可能的作用机制[14]。本研究将以THP-1 单核巨噬细胞建立炎性细胞模型，以4 种芹菜素-单-C/O-黄酮苷同分异构体（见表1）：牡荆素、异牡荆素、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、5-Oβ-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元为研究对象，评价4 种同分异构体的抗炎活性差异，为植物性食品原料膳食摄入芹菜素黄酮苷及营养特性提供指导。

表1 芹菜素及其4 种黄酮苷化学结构Table 1 Structure of apigenin and 4 apigenin glycosides

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

THP-1 单核巨噬细胞实验室保存 上海细胞库；5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、牡荆素、异牡荆素 均为HPLC纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司；RPMI 培养基 美国hyclone 公司；胎牛血清 澳大利亚Aus-GeneX 公司；GNM15140 青链霉素溶液（100X） 杭州吉诺生物医药技术有限公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，L-4391）、豆蔻佛波醇乙酯（phorbol 12-myristate13-acetate，PMA）、β-巯基乙醇 美国Sigma公司；高纯总RNA 提取试剂盒 北京艾德莱生物科技有限公司；浆蛋白与核蛋白提取试剂盒、Weatern Blot 分析试剂 美国AspenTech 公司；PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒、PCR SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ荧光定量试剂盒TaKaRa 公司；细胞因子酶联免疫试剂盒 欣博盛生物科技有限公司；所有分析用试剂均为国产分析纯。

Multifuge X1R 高速冷冻离心机、全波长读数仪Thermo Fisher Scientific 公司；ECLIPSE TS100 倒置显微镜 日本尼康公司；DYY-8C 凝胶电泳仪北京六一仪器厂；细胞培养板 美国Corning 公司；细胞培养瓶 德国Greiner 公司；MG96G PCR 仪杭州朗基科学仪器有限公司；ChemiDoc MP 凝胶成像系统 美国BIO LEGEND 公司；qTOWER2.2 荧光定量PCR 仪 德国Analytik jena 公司；AX-Ⅱ暗匣 广东粤华医疗器械厂有限公司；LiDE110 DYY-6C扫描仪 日本Canon 公司；0.45μm PVDF 膜 美国Millipore 公司；柯达医用X 射线胶片 美国Kodak公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 THP-1 单核巨噬细胞以RPMI完全培养基培养，RPMI 完全培养基由10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、0.1 μmol/L的β巯基乙醇组成，细胞于含5% CO2，90%湿度，37 ℃条件下的CO2恒温培养箱进行悬浮培养，每24 h 于倒置显微镜下观察，当密度达到70%～80%左右时进行分瓶传代[14]。

1.2.2 MTT 试验 采用MTT 法[15]测定黄酮类化合物对THP-1 单核巨噬细胞的毒性作用。

设置3 个组别：实验组，稀释细胞悬液，加入PMA 试剂（终浓度为0.1 μmol/L），接种100 μL 细胞到96 孔板中，使其密度为3×104个/孔，细胞培养板放入CO2培养箱培养。12 h 后细胞贴壁完全，去上清液，以温热的PBS 轻轻清洗细胞，去PBS，加入新鲜RPMI 完全培养基，静息24 h。以不含血清的RPMI 培养液分别配制浓度为5 μmol/L 的api-5-Oglu、api-7-O-glu、vitexin、isovitexin 溶液，去细胞上清液，以温热的PBS 轻轻洗涤细胞，去PBS，分别加入配制好的黄酮类化合物溶液。空白组，不接种细胞，加入100 μL RPMI 完全培养基培养到细胞孔板中，且以不含血清的RPMI 培养液代替黄酮类化合物溶液处理细胞孔板。正常组（CK 组），THP-1 细胞接种量同样品组，且以不含血清的RPMI 培养液代替黄酮类化合物溶液处理细胞孔板。样品组与2 个空白组均设8 个平行。

给药完成后，细胞孔板放入CO2培养箱中培养，24 h 后取出去细胞上清液，加入配制好的MTT 溶液（浓度为0.5 mg/mL），放回CO2培养箱中避光孵育3～4 h。去MTT 溶液，以150 μL 二甲亚砜溶解细胞中甲瓒结晶，于37℃震荡孵育10 min，在酶标仪上读取490 nm 处吸光值。

计算细胞存活率，公式如下：

式中：AT：样品组在490 nm 处的吸光值；AN：空白组在490 nm 处的吸光值；AC：正常组（CK 组）在490 nm 处的吸光值。

1.2.3 Western Blot 法检测细胞中环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）含量 设置3 个组别：实验组：稀释细胞悬液，接种2 mL 细胞到6 孔板中，使其密度为1.5×107个/孔，待细胞覆盖孔板底部80%～90%时，加入PMA 试剂（终浓度为0.1 μmol/L），放入CO2培养箱中培养。12 h 后细胞贴壁完全，去上清液，以温热的PBS 轻轻清洗细胞，去PBS，加入新鲜RPMI 完全培养基，静息24 h。以不含血清的RPMI培养液分别配制浓度为5 μmol/L 的api-5-O-glu、api-7-O-glu、vitexin、isovitexin 溶液，去细胞上清液，以温热的PBS 轻轻洗涤细胞，去PBS，分别加入配制好的黄酮类化合物溶液。模型组（LPS 组），THP-1细胞接种量同样品组，且以不含血清的RPMI 培养液代替黄酮类化合物溶液处理细胞孔板。正常组（CK 组），THP-1 细胞接种量同样品组，且以不含血清的RPMI 培养液代替黄酮类化合物处理细胞孔板。各组别均设3 个平行。

给药完成后，细胞孔板放入CO2培养箱中培养。3 h 后取出，正常组（CK 组）不加脂多糖，实验组和模型组（LPS 组）加入脂多糖，使LPS 终浓度为1 μg/mL，将6 孔板放回培养箱中继续培养30 min。以RPMI 裂解液裂解细胞收集细胞总蛋白样品，并采用WB 法测定总蛋白中COX-2 含量[16]，以内参计算各组别COX-2 的相对表达量。

1.2.4 酶联免疫吸附检测细胞上清液细胞因子的含量 设置3 个组别，各组别设置同1.2.3，但细胞接种密度为5×106个/孔，每孔接种2 mL 细胞悬液到12孔板中，待实验组和模型组加入脂多糖后，将孔板放回细胞培养箱中培养12 h。收集细胞上清液，依据酶联免疫法试剂盒说明书测定细胞上清液中细胞因子含量。

1.2.5 实时荧光定量PCR 法检测细胞中细胞因子mRNA 的含量 实验组别设置和细胞处理同1.2.4。以Trizol 试剂裂解去上清液的细胞，收集细胞裂解液。采用实时荧光定量PCR 法测定细胞中细胞因子mRNA 的相对含量，即以2−ΔΔC（T）法计算各组别相对模型组（LPS 组）的细胞因子mRNA 扩增倍数[17]。

样品中RNA 提取、反转录、定量方法分别按试剂盒说明书操作。

各指标引物信息见表2：

表2 荧光定量PCR 法检测细胞因子及内参引物信息Table 2 Primer information of cytokines and internal primers in fluorescence quantitative PCR

1.2.6 Western Blot 法检测细胞质、细胞核P65 含量设置3 个组别，各组别设置同1.2.3，但细胞接种密度为5×106个/孔，每孔接种5 mL 细胞悬液到直径6 cm的细胞培养皿中。待细胞孔板中实验组和模型组加入脂多糖并放回培养箱中培养30 min 后，按试剂盒说明分别收集提取细胞质与细胞核蛋白样品，采用WB 法测定样品中P65 含量[18]，以内参计算各组别P65 的相对表达量，计算方式同COX-2。

1.2.7 Western Blot 法检测细胞中IκBα、IKKβ的变化 设置3 个组别，各组别设置同1.2.3，但细胞接种密度为1×107个/孔，每孔接种2 mL 细胞悬液到6 孔板中。待细胞孔板中实验组和模型组加入脂多糖并放回培养箱培养30 min 后，以RPMI 裂解液裂解细胞，收集细胞裂解液，采用WB 法测定总蛋白中IκBα、IKKβ、P-IκBα、P-IKKβ含量[18]，以内参计算各组别IκBα、IKKβ、P-IκBα、P-IKKβ的相对表达量，计算方式同COX-2。

1.3 数据处理

实验结果表示为平均值±标准差，采用软件SAS 8.0 进行LSD 多重比较分析数据显著性，P＜0.05 表明差异显著，P＜0.01 表明差异极显著。

2 结果与分析

2.1 黄酮类化合物对TPH-1 单核巨噬细胞的毒性作用

前期研究表明，在基于脂多糖刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞建立的炎性细胞模型中，浓度为5 μmol/L 的4 种芹菜素黄酮苷同分异构体对COX-2 酶mRNA 的表达就具有显著的差异性抑制作用（P＜0.05），其中，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、牡荆素对COX-2酶mRNA 的表达显示出更好的抑制活性[19]。本研究将进一步探究4 种同分异构体在5 μmol/L 浓度下的抗炎活性差异及机理。如表3 所示，与CK 组相比，5 μmol/L 的芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元、牡荆素、异牡荆素处理下，细胞存活率无显著性差异（P＞0.05），表明上述化合物对THP-1 单核巨噬细胞均无细胞毒性作用。

表3 黄酮类化合物对THP-1 单核巨噬细胞的毒性作用Table 3 Toxicity of flavonoids on THP-1 macrophage cells

2.2 黄酮类化合物对THP-1 单核巨噬细胞炎性模型中COX-2 调控作用

如图1 所示，LPS 作用后，THP-1 单核巨噬细胞炎性模型中COX-2 的表达极显著上升（P＜0.01），COX-2 是NF-κB 核转录因子调控的下游表达产物，在特定组织器官发生炎性反应时被诱导产生，具有快速应答炎性反应的特质，是炎性反应中常用的评价指标[20]。

图1 4 种芹菜素黄酮苷对脂多糖刺激下THP-1 单核巨噬细胞中COX-2 的影响Fig.1 Influence of 4 apigenin glycosides on COX-2 in THP-1 macrophage cell lines stimulated by LPS

芹菜素等多种黄酮类化合物可以作用于巨噬细胞并对COX-2 显示较好的抑制效果[21−23]。在本研究中，牡荆素和异牡荆素均能够极显著地抑制COX-2 酶在蛋白水平上的表达（P＜0.01），且牡荆素的抑制作用显著优于异牡荆素（P＜0.05）。而在笔者前期的研究中[19]，RAW264.7 小鼠巨噬细胞中，牡荆素显示出较异牡荆素更好的COX-2 酶mRNA 活性0.05），表明在抑制COX-2 基因的转录和蛋白的表达方面，C6 位碳苷取代的牡荆素碳强于C8 位碳苷取代的异牡荆素。

2.3 黄酮类化合物对THP-1 单核巨噬细胞炎性模型细胞因子的影响

表4 表明1 μg/mL 的LPS 刺激PMA 分化后的THP-1 后，细胞内TNF-α在蛋白水平和基因水平的表达极显著增强（P＜0.01）。脂多糖是诱导细胞产生炎性反应的较强刺激物[24]，细胞内肿瘤坏死因子TNF-α含量显著提高是判断炎性发生的重要标志之一[25]。此外，脂多糖还可以促进细胞中细胞因子的表达。本实验中，LPS 刺激使IL-1β（Interleukin 1β，白细胞介素1β）的含量极显著增加（P＜0.01），同时LPS还极显著增强了IL-6（Interleukin 6，白细胞介素6）的含量（P＜0.01），极显著增加了IL-8（Interleukin 8，白细胞介素8）和IL-10（Interleukin 10，白细胞介素10）mRNA 的表达（P＜0.01）。

表4 4 种芹菜素黄酮苷对脂多糖刺激下THP-1 单核巨噬细胞中细胞因子的影响Table 4 Influence of 4 apigenin glycosides on cytokines in THP-1 macrophage cell lines stimulated by LPS

与LPS 组相比，2 种芹菜素黄酮碳苷对细胞炎性因子的抑制作用强于2 种芹菜素黄酮氧苷。4 种黄酮苷均可显著降低IL-10 mRNA 的含量（P＜0.01），但5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元对除IL-10 mRNA外其余各指标无显著抑制作用（P＞0.05）；而芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对TNF-α的产生有显著抑制作用（P＜0.05）；此外，牡荆素可以极显著抑制IL-6 的表达（P＜0.01）和TNF-αmRNA 的相对含量（P＜0.05）；异牡荆素可以极显著抑制IL-1β和IL-6 蛋白的表达（P＜0.01）、IL-8 基因的转录（P＜0.01）。综上，基于对多种细胞因子的抑制作用，异牡荆素相较于其他3 种芹菜素黄酮苷显示出最好的抗炎活性。

值得注意的是，当作用浓度为5μmol/L 时，5-Oβ-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元促进了巨噬细胞中IL-1β表达升高。脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜的主要组成部分，可以引起强烈的炎性反应，实验以1 μg/mL 脂多糖刺激TPH-1 单核巨噬细胞建立了炎性细胞模型。IL-1β是一种主要由单核巨噬细胞分泌的多效性细胞因子，作为炎症反应经典的促炎因子，在低浓度时IL-1β可以通过级联反应放大炎症反应，而局部高浓度的IL-1β则主要发挥内分泌调节作用，可以增强宿主巨噬细胞杀伤病原微生物的能力和游走能力[25]。实验浓度下的5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元对IL-1β分泌的促进作用可能由此增强宿主细胞抵御病原微生物的能力。

2.4 黄酮类化合物对THP-1 单核巨噬细胞炎性模型中P65 调控作用

NF-κB 蛋白家族迅速进入细胞核并启动各种κB 依赖性基因的表达，如细胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β，同时细胞因子可以反馈调控NF-κB[26]。P65是NF-κB 蛋白家族的重要成员，具有重要的结构转录激活域（transcription activation domain，TAD），TAD 结构的存在对于细胞因子基因表达是必不可少的[27]。

通过计算P65 蛋白对内参的相对含量，分析4 种芹菜素黄酮苷对脂多糖刺激下THP-1 单核巨噬细胞核和细胞质中P65 的影响。脂多糖作用30 min后，细胞核P65 较大程度地增加（见图2b）。芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷与8 位碳苷取代形成的异牡荆素均极显著地抑制了P65 的核移位作用（P＜0.01），即细胞核内P65 含量显著下降，异牡荆素的8 位碳苷取代强于7 位氧苷取代的抑制作用（P＜0.01），可能由此异牡荆素对P65 核转录因子调控的下游炎性指标如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 发挥了较强的抑制作用。

图2 黄酮类化合物对脂多糖刺激下THP-1 单核巨噬细胞核P65 的影响Fig.2 Effects of flavonoids on THP-1 mononuclear macrophage nucleus P65 stimulated by LSP

2.5 黄酮类化合物对THP-1 单核巨噬细胞炎性模型P-IκBα、P-IKKβ 信号通路的调控作用

通过计算相对表达量分析黄酮类化合物对脂多糖刺激下THP-1 单核巨噬细胞中IκBα和IKKβ变化。脂多糖作用30 min 后促进细胞内IκBα和IKKβ发生磷酸化反应（分别以P-IκBα、P-IKKβ进行定量）（见图3b、图3c）。5 μmol/L 芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷预处理后，对IκBα的磷酸化无显著影响（P＞0.05），5 μmol/L 5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元、牡荆素、异牡荆素则在一定程度上促进了IκBα的磷酸化，4 种黄酮类化合物均极显著促进了IκBα总表达量的增加（P＜0.01）。5 μmol/L 5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元预处理后，极显著抑制了IKKβ的表达（P＜0.01），但4 种黄酮类化合物均在一定程度上极显著地促进了IKKβ的磷酸化（P＜0.01）。这表明4 种黄酮类化合物的预处理未对LPS 刺激THP-1 单核巨噬细胞下IκBα和IKKβ的磷酸化反应发挥抑制作用。因此，4 种芹菜素黄酮苷并非通过直接抑制IκBα和IKKβ的磷酸化作用而抑制COX-2 或炎性因子。

3 讨 论

黄酮类化合物为机体组织利用并发挥不同生理活性的过程中，第一步反应即为吸收。大量研究表明黄酮类化合物在肠道的主要吸收方式为被动扩散[28−30]，而分子结构的多样性与其吸收存在本质联系，多项研究表明糖苷取代位置及数目的不同会影响黄酮类化合物的肠吸收。本团队前期关于黄酮类化合物的转运摄入实验结果表明芹菜素苷元的吸收率显著高于牡荆素和异牡荆素[31−32]。而Chen 等[33]在对异戊二烯基取代的黄酮类化合物的研究表明，当有两个或两个以上的糖基取代环上羟基时，黄酮类化合物肠吸收显著降低；减少一个糖基后能在一定程度上增加黄酮类化合物的吸收，但无糖基取代的黄酮苷元吸收却并未如预期中得以提高，原因在于苷元水溶性差（＜0.5 μg/mL）。而黄酮碳苷是一类极性相对较大的黄酮类化合物，在水溶液中具有较好的溶解性，这可能是其本研究中芹菜素黄酮碳苷较其氧苷同分异构体发挥更好抗炎活性的原因之一。

黄酮苷一般会经过水解代谢为黄酮苷元后，进一步在机体中被吸收利用[34]，吸收利用度和其在体内的作用时间也是导致不同结构黄酮苷发挥不同生物活性的原因之一。研究表明：牡荆素、异牡荆素等黄酮碳苷在大鼠体内吸收较好，吸收迅速，给药5 min均可检出，1～2 h 血药浓度达到峰浓度，但两者的吸收率相差不大，分别为5.82%与5.53%[35]。但牡荆素摄入后可快速消除，广泛分布于各组织，肝、肾组织浓度最高，主要通过肝脏和肾脏代谢排泄[36]。异牡荆素与牡荆素的消除速度不同，灌胃给药牡异荆素消除较牡荆素慢，静脉给药异牡荆素的消除速度也显著慢于牡荆素，表明C-8 位的碳苷取代导致了异牡荆素可在机体存留更长时间[37]。因此，尽管牡荆素与异牡荆素具有相近的吸收率，然而异牡荆素在机体内具有更慢的消除速度即更长的作用时间，这可能使其抗炎活性强于牡荆素。

黄酮类化合物对巨噬细胞炎性反应的抑制活性主要在于抑制NF-κB 信号通路[38]。IKKβ对NFκB 信号通路经典途径的激活发挥着不可取代的作用，在典型的NF-κB 信号通路经典途径中，IKKβ与IκBα的Ser32 和Ser36 磷酸化存在充分必要条件关系，然而IκBα磷酸化对于NF-κB 信号通路经典途径并不是必须的[29]。本研究中异牡荆素通过极显著地降低了NF-κB 蛋白家族中P65 核转录因子发生核移位作用（P＜0.01），进而极显著地抑制了下游炎性指标COX-2、IL-1β、IL-6 的表达（P＜0.01），发挥了较强的抗炎作用。但异牡荆素对P65 的抑制作用并非是通过对上游调控蛋白IKKβ和IκBα的抑制而实现的，这表明其对巨噬细胞中炎性反应的抑制活性并非依赖于IκBα磷酸化的NF-κB 信号通路。后续可对IkBα上游通路中AKT、PDK1、PI3K 等蛋白的表达进行检测分析，探究异牡荆素的抗炎机制。

4 结 论

研究基于THP-1 单核巨噬细胞评价了2 种芹菜素黄酮氧苷和2 种芹菜素黄酮碳苷的抗炎活性，结果显示芹菜素黄酮碳苷相对其黄酮氧苷具有更好的抗炎活性，尤其异牡荆素极显著抑制了COX-2、IL-1β和IL-6（P＜0.01）的表达，极显著抑制核转录因子P65 的入核（P＜0.01），发挥了最强的抗炎作用，但异牡荆素未通过抑制IκBα、IKKβ而抑制NF-κB 蛋白家族P65 的核移位作用，即在人源的THP-1 单核巨噬细胞炎性模型中，异牡荆素对抗炎活性并非是通过IκBα依赖的NF-κB 信号通路实现。