花椒叶提取物主要成分及其生物特性的研究进展

苟 鼎，张腊梅，黄红琴

（达州中医药职业学院药学院，四川达州 635000）

花椒是中国特有的香辛类作物，除花椒粒本身具有广泛的实用价值外，其主要副产物花椒叶的使用价值也越来越被重视。目前的研究表明，花椒叶可以提取出一系列化学物质，主要是挥发类、黄酮类、多糖、生物活化酶和一些生物碱，游离脂肪酸等物质，总体种类数量已经接近150 种。提取花椒叶中的有机溶液进行生化特性分析，发现其在消除羟基自由基、抑菌抗毒等方面有着较为明显的作用。本文对几种不同品种的花椒叶提取物进行成分分析，综述了目前对花椒叶成分分析的部分成果，同时介绍了有关实验和测定方法，以期对提高花椒叶的研究和利用效能做出贡献。

1 花椒叶化学成分分析

目前研究表明，通过各种方法提取花椒叶中的成分进行分析，得出的花椒叶的主要成分类似，主要有黄酮类物质、挥发油、酰胺、多糖以及生物酶，其中黄酮类物质和挥发性物质是当前研究利用的重点，成分所占比例较大。表1 中将各类物质集的主要代表物质加以罗列说明。

表1 花椒叶主要成分

1.1 挥发油

吴刚[1]，周江菊[2]，史芳芳[3]等人分别对椿叶花椒、樗叶花椒和竹叶花椒进行了物质的分离和提取实验操作。将5g 的花椒叶进行干燥并粉碎加入烧瓶中，加入蒸馏水，采用挥发油提取法提取挥发物质，进行气相色谱-质谱联用分析，其中色谱柱条件为：尺寸30m *0.25mm,0.25μm，载气种类为氦，流速5.6 mL/min;加热过程:柱初温400C，匀速升温到1000C，标定用时时长4min。再匀速升温至2600C，标定用时时长20min。质谱仪条件为离子源温度2300C;接口温度2800C，质量扫描范围m/z 30-400;电离电压70 eV;溶剂延迟时间2min。

实验分离出了挥发性成分。通过对比发现，三种花椒叶的挥发油成分主要以烯类物质，单氧原子醇、双氧原子酯，单氧原子酮类物质为主，偶有醛类物质和酸类物质。图1是三种花椒叶成分的含量占比图。通过图1可知三种花椒叶在物质集上重合度较高，在各分子的具体含量上统一性较小同时三种花椒叶中，烯类物质分子式主要以C10H16C15H24为主，醇类物质主要以C10H18O、C15H26O 为主，酯类物质分子式C12H20O2，酮类物质分子式主要以C10H16O 为主。上述物质在分子结构上存在较多的相似性，且有一定比例的分子结构的手向性。表2 将目前研究分流出的主要化合物进行列举，通过与图1 对比可知，不同的花椒叶其化合物的种类、含量差异较为明显。

表2 花椒叶总体化合物的种类

由图1 可知三种花椒叶的挥发油成分主要集合在烯类化合物，醇类化合物范围内，椿叶花椒叶的挥发油成分中较为突出地含有大量的酮类化合物，酯类化合物和酸类化合物偶见于樗叶花椒叶中。上述物质在色觉和味觉上具有类似表现，因此在一定程度上可以解释不同种花椒叶的生理试验的相似性。

图1 花椒叶挥发油成分对比

1.2 黄酮类物质

黄酮类物质具有较大的药用价值[4-5]，其主要表现在体内外抗自由基氧化破坏能力较强，且对常见致病杆菌和一些病毒的活性抑制能力较强。杨立琛[6]等人分别进行了花椒叶的黄酮类物质的提取，称取一定量的花椒叶粉末，按1:30 的料液比加入浓度为65%乙醇溶液为溶剂，放入微波玻璃反应器中，选择微波功率为500 W，在600C 下用微波萃取仪萃取4 min,待提取液冷却后进行过滤，滤液经石油醚萃取以除去叶绿素等脂溶性成分，去掉石油醚层，得到了花椒叶黄酮的提取液。他们的结果表明黄酮类物质中主要以金丝桃苷和槲皮苷为主。孙晨倩[7]和纪珍珍[8]分别在各自的实验研究中利用上述方法测算出了黄酮类物质的质量分数为133.63g/kg,15.97mg/g。陈红林[9]进行了陕西三种品种的花椒叶的黄酮类物质的质量分数的测定，具体方法为称取三种经过粉碎的三种花椒叶各1g,按照料液比1:30 在每份中加入80%甲醇溶液30mL，温度设置为500C，进行超声波震荡提取持续40 min，过滤后称取50ml 进行实验，再加入芦丁C2H60,NaOH,CHC13,Al(N03)39H20,NaNO2等制剂，均匀后利用紫外/可见光光度计进行分析，经过测定在2017 年6 月和8 月花椒叶的黄酮类物质的质量分数均值为14.07mg/g和11.69mg/g。范箐华[10]等人利用溶液萃取法，分别用三种溶液进行了黄酮提取，三次实验的黄酮提取率均值为3.45%。黄酮类物质的提取实验较为复杂，从原理上划分主要是以化学萃取，物理萃取和生物质等方法为主。表3 中将目前几种主要的实验方法和原理进行了总结。

表3 黄酮类成分提取方法

1.3 酰胺

酸胺类化合物是导致花椒呈现味觉上的辛麻感的主导原因，目前研究结果表明花椒叶中的酰胺类物质的存在集群是脂肪酸胺为主，且其不饱和性比例较高。陈槐萱[11]将干燥花椒叶和果皮分别粉碎，按料液比1:10 加入氯仿，250C 下进行混合过滤，对滤渣再次进行上述操作，合并两组过滤后的液体进行旋转蒸发操作，纯化后的液体进行色谱分析，发现提取物的主要物质为山椒素类物质，具体分子形式有三种。苟鼎[12]等人利用乙醇进行花椒叶中分离成分的萃取保有试剂，采用微波震动能量系统对花椒叶中的花椒素进行分离和提纯，得出了在温度为298K，功率在0.4KW 的条件下，其最大山椒素提取量为5.98mg/g。

1.4 糖类和蛋白质

孙晨倩等对花椒叶进行了糖类的提取和质量测定，取适量花椒叶样品粉末，按照料液比1∶40 加入纯水进行均匀搅拌，搅拌后的液体在25℃的条件下用60W 的超声波仪器进行辅助提取30min;随后进行离心过滤，并冻干封存，采用GB50095—2010 方法进行测定，经过实验测定其多糖含量为8.5g/kg。其对花椒叶进行的蛋白质测定实验表明蛋白质含量丰富，且其中的氨基酸种类基本为人体进行正常活动所需氨基酸[13]，所测定的花椒叶中的必需氨基酸在氨基酸总类中占比达到了0.46。纪珍珍对凤县花椒、野生花椒等花椒叶作了不同时期的蛋白质提取分析实验，按照GB/T50095-2010 中蛋白质的测定方法中的自动凯氏定氮仪法进行测定，其中称取样品1g，精确至0.001g。研究发现7 种花椒叶的蛋白质含量的总提变化范围在9.8g/100g 到22.7g/100g。孙伟[14]等人利用超声波设备仪器对花椒叶进行多糖的提取并进行了提取能力的评估测算，发现在温度为342K，醇沉浓度为0.9，料液比为1:20g/ml 时，多糖的提取响应值最大，可达到0.981%，与理论值0.990%非常接近，响应效果十分良好。

1.5 其他成分

除上述成分外，花椒叶中还含有一定比例的脂肪、酚类、粗纤维和灰分等[15]。其中酚类具有一定的药用价值[16]，有一定的健康导向的血糖调节能力，并对于心脏和脑部的血液和血管系统有一定的保护能力。孙晨倩和纪珍珍分别进行了花椒叶的酚类含量的测定，分别为552.71g/kg,23.66mg/g。两人对于花椒叶中脂肪的测算结果均表明，花椒叶中的脂肪含量较低，有益于人体良性发展。对于有机纤维和无机灰的测定结果的含量比例分别超过了0.05 和0.06。

2 花椒叶提取物的生物特性作用分析

花椒叶提取物具有一定的药用作用，比如抑制身体内的炎症症状及反应，降低病毒活性毒性，促进血糖的正向调节。具有上述功效的重要原因是其在体内外抗氧化活性，抑菌抗毒性和酶生化活性等方面具有一定程度的作用能力。

2.1 抗氧化活性

羟基和自由基对生物细胞的衰老性作用呈现正相关，原因是自由基会对细胞内的蛋白质和核糖核酸等物质造成氧化性腐蚀[17]。周江菊等对樗叶花椒叶的提取物进行了自由基类物质的清除能力测定，取用一定量的花椒叶纯化提取物溶液，再加入0.05mol/L 的Trics-HCL 的溶液进行水浴加热，再加入邻苯三酚和盐酸溶液进行水浴加热，温度均为250C,然后进行吸光度的测定，进而测定清除率。由图2 可知，樗叶花椒叶的提取物对自由基进行氧化破坏的抵制能力较强，清除比率较高。自由基的清除能力与提取物的作用数量呈现正向的类线性关联。对在0.5g/ml 到3g/ml 的浓度变化范围内，三种自由基的清除比率的斜率较大，在3g/ml 到4g/ml 时，三种自由基的清除比率的斜率较小，几乎不再发生变化。

图2 樗叶花椒叶的提取物对三种自由基清除效果

王征帆[18]等利用超波提取法对大红袍花椒的花椒叶进行了内容物的提取，以乙醇溶液为溶剂，将提取物溶液分别加入到放有超氧自由基和羟基自由基的溶液中进行反应，采用比色法对反应结果进行处理。大红袍花椒叶的提取物对两种自由基一定程度清除效果如图3 所示。该实验分别加入了0.2ml，0.4ml，0.6ml 和1ml 的花椒叶提取物溶液，随着提取液质量的增加，两种自由基的清除比率均增加，且对超氧自由基的清除效果要低于羟基自由基的清除效果。李君珂[19]等通过对加入花椒叶提取物的白鲢咸鱼的脂肪含量和脂肪酸含量与不加入花椒叶提取物的同种咸鱼进行对比，发现加入花椒叶提取物后游离脂肪酸含量降低而脂肪含量相对较高，证明了花椒叶提取物在一定程度上阻止了脂肪被氧化成脂肪酸的进程。

图3 大红袍花椒叶提取物对两种自由基的清除率

苟鼎等利用微波提取法对花椒叶成分进行提取，主要提取产物为山椒素，其展开山椒素的抗氧化活性的实验，以铁还原力、0H 自由基清除能力和ABTS 自由基清除能力模型来评价花椒叶山椒素抗氧化能力，实验结果如图4 所示。结果表明山椒素的抗氧化活性能力显著，且与山椒素的施加浓度呈现正相关关联。

图4 花椒叶山椒素的抗氧化活性测定

2.2 抑菌性

施瑶[20]等利用乙醇溶液对花椒叶提取物进行萃取，以变形链球菌、放线菌和嗜血放线伴生杆菌为实验对象，利用琼脂扩散法和最低抑菌浓度法进行实验。将萃取溶液滴入含有口腔疾病致病细菌的培养基中，结果表明萃取溶液对致病细菌的活性抑制呈现正向关联，且与浓度正相关。龚晋文[21]等利用花椒叶提取物对大肠杆菌等常见菌类进行混合实验，发现在一定条件下，提取物溶液对上述菌群的活性及其增殖性均有破坏性效果。其中抑制效果与提取物的溶液浓度正相关，与溶液环境的碱性指向性正相关，且在酸性条件下，提取物的抑菌效果不明显。李克坤[22]对花椒叶提取物进行了物质分离和结构扫描，并对分离后的化学成分进行了临床的药物敏感性实验，发现分离成分对除大肠杆菌之外的常见致病性细菌和真菌，如引起皮肤真菌感染和病理性肺炎的菌群的抑制和杀灭能力显著。吕可[23]等将花椒叶进行浸泡，将浸泡一定时间的液体进行盆栽植物的浇灌。该实验对盆栽载体中的各类真菌和细菌等数量进行观察记载，发现在浇灌后一段时间内，培养载体内的多数细菌和真菌类生物的数量和活动活性均呈下降态势。且浸泡液的质量浓度在40g/L,其对细菌的抑制效果最好，此时细菌群落数量同比下降超过22%。孙伟等利用花椒叶提取物进行了痢疾和伤寒类疾病致病的菌群作用效果实验，结果表明花椒叶提取物对上述细菌群落的抑制作用均呈现正向关联。

2.3 酶化活性

吕可等通过研究发现，花椒叶浸泡叶作用过的盆栽植物载体土壤中，根际土蛋白酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性明显低于非根际土相应的酶活性,而过氧化氢酶和多酚氧化酶活性则显著升高。土壤的蛋白酶活性与蔗糖酶活性重合度极高,多酚氧化酶活性与蔗糖酶活性重合度极高。孙晨倩等利用黑腹果蝇进行生物体内的花椒叶醇溶物的酶活性影响评估，发现花椒叶醇溶物对S0D 等指标呈现正向作用关系。

2.4 亚硝酸根的清除活性

亚硝酸根较为广泛地存在于大白菜等绿叶蔬菜中，且亚硝酸根极易形成亚硝酸盐等致癌性物质。在世界范围内，亚洲人患胃癌的比例较大。中国东北部地区人口患胃癌的几率要高于全国平均水平，原因在于上述地区的人口喜食高盐和腌制类食品。清除亚硝酸根是有效防止胃癌的手段之一。周江菊等进行了樗叶花椒叶的提取物在体外进行亚硝酸根的清除模拟实验，数据如图5 所示。实验发现花椒叶提取物对亚硝酸根的毒性转化能力具有抑制作用，且花椒叶提取物的浓度与亚硝酸根的毒性转化抑制效果呈正相关的关联，在浓度为4mg/ml 时，亚硝酸根清除比率最大，超过了86%。

图5 花椒叶提取物对亚硝酸根的清除作用

2.5 其他活性

张大帅[24]等利用花椒叶提取物对肿瘤细胞进行抑制实验，发现其对于一种血癌细胞的抑制作用呈现明显正向关联，且在较低浓度时的抑制作用灵敏度较高，实验的另外三种癌细胞均能被提取物溶液抑制，相对于实验中的血癌细胞，其在较大的溶液浓度能表现出一定的抑制反应灵敏度。

3 结论与展望

花椒作为中国饮食文化的一种特殊而不可或缺的存在，对于中国的饮食文化和中国人的饮食习惯均有重大贡献。中国种植花椒的面积极广，品种繁多。在利用好花椒粒的同时，充分利用好主要副产物的花椒叶是一个不可忽视的问题。根据对花椒叶的有关成分的分析，其主要成分有黄酮类物质、挥发油、酰胺、多糖、生物酶等物质，其中对于挥发油的提取方法较为单一，主要挥发油提取法提取挥发物质，进行气相色谱-质谱联用分析，该种方法耗费时间较长，其容易受杂质影响，因此后续研究可优化考虑优化上述影响；对于黄酮类物质的提取方法较多，目前主流的提取方法列表在文中，目前常用的溶液萃取法操作较为繁琐，流程周期较长，超临界萃取法需要特定的物理设备，如采用则需要一次性较大资金投入，生物酶解法相对前两者优点明显，投入少，时间短，但是会有酶解出的其他生物分子的干扰因素，因此后续研究可以重点考虑生物酶解的纯化工作。对于酰胺和多糖的提取工作，目前主要以国标的方法进行，有操作流程长，需要的化学制剂太多的缺陷，因此后续工作可以进行相关的优化研究。对于花椒叶提取物所展现的抗氧化活性、抑菌性、酶化活性等在食品卫生中已经有了较为不错的应用，但是应用领域较窄，后续研究可以推进应用的拓宽，对于其药用和医学价值的应用，现在只在极少数的领域如中药和几种西医的临床实验中进行应用[25]，因此后续研究可以考虑是否可以推进其在更加广泛的临床医学和制药等方面的研究和应用。推动花椒叶的有关研究，有利于提高花椒属作物的整体利用率和经济性，有利于完善花椒产业链的发展。