尿源干细胞及其细胞外囊泡在再生医学中的研究进展

徐依赟， 邱 雨， 吴氢凯

(上海交通大学附属第六人民医院妇产科,上海 200233)

尿源干细胞(urine-derived stem cells, USCs)是指从尿液中提取的具有良好扩增能力、多系分化潜能、旁分泌功能的一种新型多能干细胞[1]。干细胞根据其发育潜能分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。根据干细胞发育阶段又分为胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)和成体干细胞(adult stem cells, ASCs)。ESCs来源于胚泡的内部细胞团，能够分化为三胚层组织，具有形成完整个体的潜能，属于全能干细胞。ESCs因其伦理争议和成瘤风险在临床治疗中受限制[2]。ASCs来源于已分化组织中的未分化细胞，能够分化为单种或多种组织、器官，具有有限的自我更新能力和分化潜能，属于多能干细胞或单能干细胞。ASCs包括间充质干细胞，造血干细胞，神经干细胞，血管内皮干细胞，肝干细胞，上皮干细胞等。根据USCs的来源和生物学性质，USCs属于ASCs的一种类型。在再生医学研究中，研究最多的是间充质干细胞(mesenchymal cells, MSCs)。目前，已经从许多不同组织中成功分离出MSCs，包括骨髓、脂肪、软骨、骨骼肌、脐带、胎盘等[3]。但大部分MSCs的获得需要侵入性操作，并且存在潜在的并发症，包括疼痛、感染、出血等。USCs可采用非侵入方法收集，具有获取简单、多次重复、来源丰富、无创无痛的优势[4]。USCs作为一种自体来源的干细胞，具有稳定增殖和多向分化的能力，是组织工程修复潜在的种子细胞。USCs来源的细胞外囊泡(extracellular vesicles secreted by urine-derived stem cells, USCs-EVs)通过释放生物活性物质发挥与USCs类似的生物学作用。作为一种无创获取的干细胞及其衍生物，从尿中分离出来的USCs及EVs，有望成为再生医学的新希望。

1 USCs的来源、分离、培养及生物学特征

1.1 USCs的来源

2008年，Zhang等[5]首次报道成功从人尿液中提取出具有干细胞特性的细胞。自此，打开了研究USCs的大门。Bharadwaj等[6]从接受男性肾脏移植的女性患者的尿液中分离及培养人USCs，随后观察到细胞中含有“Y”染色体，并且高表达肾脏特异性基因CD224、CD13、NR3C2、CD146、PAX2、PAX8，由此推测USCs可能起源于肾脏。

1.2 USCs的分离及培养

USCs具体的分离培养方法[7]如下: (1) 收集无菌中段尿液，加入抗生素防止污染，离心收集沉淀；(2) 磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀两次；(3) 沉淀物重悬于USCs培养基；(4) 将悬浮液接种到预先明胶包被的24孔板，放入5% CO2、37 ℃培养箱培养。约3～8 d，即有细胞克隆形成。此外，尿液离体后样本保存时间和方式是至关重要的，与USCs的活性息息相关。新鲜的尿液样本应储存在4℃条件下，并且在尽量短的时间内分离USCs。Lang等[8]通过优化尿液离体后的保存技术，发现即使经过24 h的储存和运输，依旧可以保持USCs的细胞活力和细胞特性，例如在细胞形态、增殖方式、表面标志物表达、自我更新能力、分化能力、端粒酶活性、染色体稳定性等方面。与传统干细胞的获取方式相比，USCs的分离仅需简单的离心，成本低廉，无需住院、活检和手术等额外支出，是比较理想的自体干细胞来源[9]。

1.3 USCs的生物学特征

USCs呈短梭“米粒样”外观，生长曲线呈典型“S”形，有足够的端粒酶长度和高端粒酶活性，具有高度的扩增能力、良好的分化能力且无成瘤风险。研究表明，USCs培养大约4周后，单个USC克隆可以获得3.8×108个细胞，200 mL尿液样本产生的平均细胞数可达到约5.0×109个[10]。由此推算，24 h的尿液收集即可获得足够数量的细胞，能够满足大多数患者临床应用的需求。USCs经过数代培养后，染色体数目保持稳定，并且在裸鼠皮下移植后，无肿瘤或恶性组织形成[11]。USCs表达关键间充质干细胞标志物(CD44、CD73、CD90、CD105)，周细胞标志物(CD224、CD146)和多能干细胞标志物(OCT3/4, C-MYC, SOX2，SSEA-4)，不表达造血干细胞标志物(CD34、CD45)[9]。此外USCs还表达小部分内皮细胞标志物，平滑肌细胞标志物和间质细胞标志物。虽然USCs目前尚没有特异性的标志物，但通过可靠、稳定的提取培养办法，联合多种USCs标志物，可以对其进行初步鉴定。USCs不仅具有成脂肪、成骨、成软骨三系分化能力，还可以分化为其他细胞系，如尿路平滑肌细胞、尿路上皮细胞、神经细胞、内皮细胞等[12]。USCs的生长形态、表面标志物、高度增殖能力和三系分化潜能符合国际细胞疗法协会(International Society for Cellular Therapy, ISCT)对MSCs的定义，因此USCs可能是MSCs的新成员。研究者发现来源于不同供体的USCs克隆进行分化时，表现出不同的分化能力。这说明人体尿液中存在不同分化阶段，不同分化潜能的USCs，由此推测USCs应是一个干细胞群，而不是单一类型的细胞[13]。近年来，干细胞疗法作为一种新的治疗手段在再生医学邻域十分热门。MSCs具有高度自我更新、多向分化潜能的特点，能够分化成不同细胞系，促进相应受损器官、组织的再生与修复。但是，大多数MSCs移植治疗仍存在来源操作有创性、伦理问题、致畸风险、免疫排斥等问题。USCs具有来源无限、安全无创、可自体取材等独特的优点，在再生医学领域具有广阔的临床应用前景。尿源干细胞及细胞外囊泡的应用见图1。

图1 尿源干细胞及其细胞外囊泡的应用Fig.1 The application of USCs and USCs-EVs

2 尿源干细胞在再生医学中的应用

2.1 USCs在泌尿生殖系统疾病治疗中的应用

USCs与泌尿生殖道组织在胚胎发育期间具有同源性，非常适用于泌尿、生殖系统疾病的治疗。

2.1.1 USCs在肾脏疾病中的应用 肾脏疾病发病原因复杂，发病率高。目前临床多采用肾脏替代疗法，如透析或移植。但是透析只能够延缓疾病发展和延长患者生存周期，而肾脏移植更是面临肾源少、费用高的难题。近年来，研究者们发现干细胞疗法为肾组织再生修复提供了新的选择[14]。与脂肪来源的干细胞(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)和羊水来源的干细胞(amniotic fluid-derived stem cells, AFSCs)相比较，Choi等[15]发现USCs能够分泌更多的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor, PDGF-BB)，具有更强的旁分泌作用。人类白细胞DR抗原(human leukocyte antigen DR, HLA-DR)在免疫反应中起核心作用。USCs表达最低的HLA-DR，减少了触发免疫反应的可能。同时，研究者发现在肾分化培养基中，USCs的干细胞标志物(OCT4、SSEA-4、CD117)表达随着时间逐渐下降，肾谱系特异性标志物(PAX2、WT1、CADHERIN-6、LIM1、CD24、OCLN)表达上升，这与传统干细胞相似。USCs不仅可以通过分泌生长因子间接影响肾脏细胞的再生，也可以直接分化为肾脏细胞发挥治疗作用。因此，将USCs作为肾脏再生的干细胞来源是较好的选择。在顺铂诱导的急性肾损伤大鼠模型中，Sun等[16]将绿色荧光蛋白标记的USCs通过尾静脉注射给予治疗，并检测到其定位在肾脏，抑制促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素6(interleukin-6, IL-6)，减少凋亡相关蛋白，如B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2-associated X, Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)，并观察到血尿素氮、血肌酐降低，肾小球损伤减轻，肾脏功能改善。同时，在USCs移植治疗毒性药物和缺血再灌注损伤引起的慢性肾脏疾病动物模型中，观察到USCs能抑制炎症反应，并具有减弱氧化应激反应、抗纤维化等作用[17]。Guo等[18]发现将USCs与猪源性肾脏细胞外基质共培养后，可形成3-D肾小管样类器官。该类器官对肾毒性药物丙酮和顺铂敏感，为肾毒性药物的筛选和研究提供了一种替代方法，为个性化医学的肾脏建模和肾脏疾病的研究提供了新思路。

2.1.2 USCs在膀胱/尿道重建中的应用 USCs不仅可以用于肾脏组织损伤的修复，还可以用于膀胱或尿道的组织工程重建。据报道[6]，使用特殊培养基诱导分化USCs，USCs能够表达尿路上皮细胞标志物(Uroplakin-Ⅰa/Ⅲ, CK7, AE1/AE3),平滑肌细胞标志物(α-SMA, Desmin)。Bodin等[19]发现USCs不仅能够在体外诱导分化为尿路上皮细胞和平滑肌细胞。将USCs接种至细菌纤维素支架上，并且植入小鼠体内，还能观察到多层尿路上皮样结构形成，有助于探索组织工程尿道的建立。同时，Wang等[20]成功将USCs诱导分化为具有收缩表型的平滑肌细胞，然后接种到血管细胞外基质(vessel extracellular matrix, VECM)，并应用到兔体内进行输尿管重建，观察到多层尿路上皮和平滑肌组织形成。该策略可在未来用于临床长段输尿管的重建。

2.1.3 USCs在生殖系统中的应用 目前，干细胞对勃起功能障碍的修复作用已在多种动物模型上得到验证，并且取得了一定的效果[21]。USCs在相关方面的研究较少。在2型糖尿病勃起功能障碍大鼠模型中，Ouyang等[22]发现向大鼠海绵体腔内注射USCs或转染碱性成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2, FGF2)的USCs，能够增加海绵体内皮细胞细胞和平滑肌细胞标志物表达，升高海绵体内压和海绵体内压/主动脉压比值，改善大鼠勃起功能障碍。FGF2是体内诱导血管生成并促进新血管生成的重要生长因子。该研究表明USCs能够改善勃起功能障碍可能与其促血管生成旁分泌作用相关。此外，Zhang等[23]发现海绵体腔内注射USCs可恢复海绵体血管内皮细胞的自噬活性，有助于减轻海绵体内皮细胞功能障碍，并最终改善由糖尿病引起的勃起功能障碍，这可能与USCs能改变受体细胞自噬活性作用相关。

2.2 USCs在骨骼系统修复方面的应用

近年来，USCs成为骨与软骨组织修复的良好候选细胞。Sun等[24]成功从同一个体中分离出USCs和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)。在体外实验中，USCs与BMSCs相比具有更好的增殖、集落形成和迁移能力，BMSCs与USCs相比具有更好的成骨、成软骨和成脂肪能力。然而，体内软骨再生修复是一个复杂的过程，与植入物与宿主细胞的相互作用、免疫反应、局部营养供应等各种因素相关。为进一步探索体内促软骨生成效果，研究者将载有USCs或BMSCs的脱细胞软骨细胞外基质支架植入兔膝关节软骨缺损模型，12周后发现两者之间的软骨修复效果没有显著差异。这表明了USCs替代传统干细胞进行软骨修复的潜力。USCs的成骨和成软骨分化机制复杂，是多种信号通路共同作用的结果。目前相关与这方面的研究较少，仍需更多的研究来证明。

2.3 USCs在创面修复方面的应用

创面修复是一个动态、连续的过程，目标是实现组织的再生和功能的恢复，包括3个阶段: 炎症、增殖和组织重塑。新血管的形成是伤口愈合中的关键步骤，而血管内皮细胞在再生组织的血运重建中起着关键性作用。研究表明，USCs可分泌促血管生成因子，并且在体外、体内都能分化为功能性内皮细胞，是血管生成和血管组织工程理想的自体细胞来源[25]。在创面修复的研究组，USCs常常与其他生物制剂联合使用，进一步提高治疗效果。Fu等[26]将负载USCs的聚己内酯/明胶(polycaprolactone/gelatin, PCL/GT)覆盖兔全层皮肤缺损，效果明显优于单一PCL/GT覆盖或USCs移植，可观察到伤口闭合加快，上皮化加速，胶原蛋白含量和血管生成增加。还同时发现USCs上清液富含血管生成相关因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、转化生长因子β1(transfo-rming growth factor beta 1, TGF-β1)，可促进人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)增殖、迁移、管形成等。

3 尿源干细胞来源的细胞外囊泡在再生医学中的应用

EVs是细胞旁分泌功能产生的纳米级膜泡，其内携带多种生物活性物质，如微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、蛋白质和脂质等，通过细胞间通讯调节靶细胞的生理、病理过程[27]。根据EVs的合成和释放方式，分为起源于内吞途径的外泌体、质膜释放的微囊泡和凋亡产生的凋亡小体3种亚型。常见的分离提取方法有差速超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、尺寸排除色谱法、免疫吸附法和沉淀法等[28]。国际细胞外囊泡学会(The International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)的最新“细胞外囊泡研究共识”表明[29]，每一种分离方式都有其自身的优势与缺陷，不存在绝对最佳的分离方法，研究者应根据后续的应用条件自行选择。研究结果表明，干细胞可能通过旁分泌功能分泌EVs发挥生物学效应。

USCs-EVs是由USCs分泌，直径30～150 nm之间的脂质双分子层纳米结构囊泡，携带了大量USCs相关的生物活性成分。USCs-EVs能够释放生物活性物质，激活胞内相关信号通路，进而调控细胞的功能和生物学行为，如细胞增殖与凋亡、血管生成、炎症反应、免疫应答等[30-31]。在TGF-β1诱导佩罗尼氏病(Peyronie’s disease, PD)大鼠模型中，Yang等[32]通过注射USCs-EVs发现可减轻由TGF-β1/Smad信号通路引起的纤维化，抑制成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，可明显改善白膜纤维化并增强勃起功能。在USCs-EVs修复组织损伤的研究中，多种miRNAs也发挥了重要作用。Li等[33]进行体外实验证明，USCs-EVs通过传递其包含的微小RNA-146a-5p(miR-146a-5p)等多种miRNA，降低白介素-1受体相关激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1, IRAK1)，继而抑制核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信号通路的激活，保护人肾皮质/近端小管细胞(human kidney cortex/proximal tubule cells, HK2)免受伤害。除抑制炎症反应外，Duan等[34]研究表明USCs-EVs富集miR-16-5p等多种miRNAs，可通过抑制VEGFA，进而改善高葡糖诱导人足细胞(human podocytes, HPDCs)凋亡，为糖尿病肾病的治疗方案提供新见解。USCs-EVs能够利用USCs的有效成分，促进损伤细胞再生，加速器官组织修复，可作为再生医学的新型无细胞治疗(cell-free therapy)方法，具有很大的应用前景。但目前研究数据较少。USCs-EVs对于组织再生的治疗效果及其机制还需进一步评估。

4 结 语

USCs作为一种较新的理想干细胞来源，能够为组织、器官的修复与再生提供新希望，为干细胞的临床转化和再生医学方面提供了新的方向。

但是在真正应用于临床前，许多问题均需要继续展开相关实验进行研究。例如，USCs分离与培养方法的优化、鉴定标准的确立、质量判断的统一等。此外，旁分泌衍生物USCs-EVs高效提取方法的改进、提取成本的节约、储存活性的保持等也需进一步改进。在许多实验研究中，USCs与USCs-EVs的移植方式、数量、频率、与其他生物材料结合的最佳方式还处于探索阶段，未形成基本共识。这些都有待于更多的体外实验和体内实验来探索和研究。总的来说，USCs及其USCs-EVs在临床中的实际应用中尚处于起步阶段，真正走向临床还有很多问题需要解决。