药用胶塞中二丁基二硫代氨基甲酸锌的高效液相色谱分析方法研究

谢兰桂，袁淑胜，韩小旭，杨会英，赵 霞*，肖新月

（1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.国家药品监督管理局药用辅料质量研究与评价重点实验室，北京 100050）

药用胶塞是药品包装材料中一类典型的密封制品，常与玻璃、陶瓷等包装容器搭配使用，用于包装药用液体和固体制剂。药用胶塞由橡胶配合适宜的助剂制备而成。胶塞中常用助剂有硫化剂、促进剂、防老剂、填充剂、防焦剂、着色剂以及活性剂等。

硫代氨基甲酸锌是常见的促进剂[1]。然而，硫代氨基甲酸锌可释放游离仲胺，与亚硝化剂反应生成N-亚硝胺[2]。亚硝胺可增大食道癌、咽癌、膀胱癌、肺癌、胃癌和白血病的患病风险，也可能导致操作工人出现鼻出血、眼喉灼热、声音嘶哑、咳嗽、恶心和头痛的症状。为保障橡胶产品生产者以及使用人员的健康和安全[3-4]，《化学药品与弹性体密封件相容性研究技术指导原则（试行）》[5]将硫代氨基甲酸锌类化合物（包括二甲基二硫代氨基甲酸锌、二乙基二硫代氨基甲酸锌和二丁基二硫代氨基甲酸锌[6]）列为药用密封件慎用助剂，GB 9685—2016《食品接触材料及制品用添加剂使用标准》[7-8]将二乙基二硫代氨基甲酸锌列为食品接触材料及制品需要控制用量的助剂，并规定了二乙基二硫代氨基甲酸锌最大使用量（占总基材质量的百分比）不得超过1.5%。

虽然《化学药品与弹性体密封件相容性研究技术指导原则（试行）》《食品接触材料及制品用添加剂使用标准》对硫代氨基甲酸锌类化合物有限量使用要求，但未收录定量分析方法。检索发现文献中鲜有报道药用胶塞中二丁基二硫代氨基甲酸锌的定量分析方法，而类似化合物二甲基二硫代氨基甲酸锌的定量分析方法有化学分析法[9]、快速比色法、高效液相色谱（HPLC）法。化学分析法[10]和快速比色法[11]干扰因素多，不适合作为精准定量分析方法。HPLC法准确、高效[12-13]，更适合作为药用胶塞的质量控制手段，也方便今后建立标准分析方法。二丁基二硫代氨基甲酸锌为金属螯合物，即为2个或多个配体与同一金属离子形成螯合环配合物。金属螯合物在HPLC上的保留行为并不理想[14-15]，谱峰拖尾、稳定性差，出现多个谱峰是常见现象[16]。本研究通过排除不稳定因素，建立了可简便、准确、稳定、经济地定量分析二丁基二硫代氨基甲酸锌的HPLC方法，为建立二丁基二硫代氨基甲酸锌的标准分析方法奠定基础。

1 实验

1.1 试剂和样品

二丁基二硫代氨基甲酸锌对照品，中国食品药品检定研究院提供；四氢呋喃，国药集团化学试剂有限公司产品；乙腈，色谱纯，美国霍尼韦尔公司产品；纯化水，自制；液氮，北京普莱克斯实用气体有限公司产品；药用胶塞（3批），某企业产品。

1.2 仪器

Mettler XS205DU 型电子天平，美国梅特勒-托利多公司产品；HPLC仪，美国沃世特公司产品。

2 结果与讨论

2.1 HPLC测试条件优化

2.1.1 优选色谱柱

从分离类型和经济角度出发，考察了2种色谱柱的分离效果。A号色谱柱为Sunfire C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国沃世特公司产品），搭配的流动相为四氢呋喃-乙腈（35∶65）（体积比，下同）；B号色谱柱为离子色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司产品），搭配的流动相为甲醇-磷酸二氢铵水溶液（90∶10）。

结果显示：A号色谱柱的出峰时间稳定，谱峰峰形尖锐；B号色谱柱的出峰时间漂移，且可见解离峰。因此，选择Sunfire C18色谱柱进行检测。

2.1.2 优选溶剂

二丁基二硫代氨基甲酸锌溶于苯、四氯化碳、氯仿、二硫化碳，微溶于醋酸乙酯、丙酮，不溶于水[17-18]。为建立适用于二丁基二硫代氨基甲酸锌的HPLC分析方法，首先应探索其在常规HPLC分析用溶剂中的溶解性。

经过了近三年的数百次试验、改进，全色系的水醇体系油墨最终研制成功，并在一些企业应用。同时，配套研发了干燥装置、回收装置。由于从源头解决了绝大多数VOCs的排放问题，所以过程控制和回收装置使用相对简单，成本低、效果好，不但做到了印刷现场VOCs排放双达标（经第三方检测），而且不用改版，印刷质量完全达到溶剂油墨的效果，印刷速度达到溶剂油墨的80%以上，油墨的使用成本也低于溶剂油墨。由于VOCs排放完全达标，解决了环境污染的困扰，因此使用厂家数量不断增加。预计，随着这种新型环保油墨的不断推广，软包装领域的VOCs污染问题可以得到解决。

本工作考察了二丁基二硫代氨基甲酸锌对照品在甲醇、乙腈、四氢呋喃3种溶剂中的溶解性。通过配制质量浓度为0.75 mg·mL-1的对照品溶液得出，二丁基二硫代氨基甲酸锌在甲醇中不易溶解，在乙腈中可超声溶解，在四氢呋喃中易溶解。考虑到四氢呋喃对液相体系有一定的腐蚀作用，不适合使用纯四氢呋喃溶解对照品，因此使用四氢呋喃与乙腈混合溶剂溶解对照品。配比试验结果显示，对照品在四氢呋喃-乙腈（10∶90）中溶解良好，因此选择四氢呋喃-乙腈（10∶90）作为溶剂。

2.1.3 优化流动相

在相同色谱条件（Sunfire C18柱，流动相流速1 mL·min-1，波长 254 nm，柱温 30 ℃，进样量 2 μL）下，参考相关文献，考察了甲醇-磷酸二氢铵水溶液（90∶10）、四氢呋喃-乙腈-磷酸二氢铵（25∶50∶25）、四氢呋喃-甲醇（35∶65）、四氢呋喃-乙腈（35∶65）4种流动相对二丁基二硫代氨基甲酸锌对照品HPLC行为的影响。

试验结果显示，在4种流动相中，二丁基二硫代氨基甲酸锌均可出峰。在甲醇-磷酸二氢铵水溶液（90∶10）、四氢呋喃-乙腈-磷酸二氢铵（25∶50∶25）流动相中，二丁基二硫代氨基甲酸锌出现不同程度的解离，其原因是二丁基二硫代氨基甲酸锌为金属螯合物[19-20]，配体二丁基二硫代氨基甲酸与金属离子锌形成了4个配位键[21]，其中2个配位键由配体上酸性基团解离去H＋后与金属离子锌配位形成，另两个配位键由2个配体上含孤电子对S与金属离子锌配位形成。二丁基二硫代氨基甲酸配体与金属离子锌配合后形成四原子环，四元环是热力学不稳定体系，易发生解离，且即使溶剂体系中含有缓冲盐也难以抑制其解离。

考虑到解离需要适宜的溶剂环境，尝试除去水相环境抑制解离，采用四氢呋喃-甲醇（35∶65）、四氢呋喃-乙腈（35∶65）两种流动相进行试验。结果显示，在上述两种流动相中，二丁基二硫代氨基甲酸锌的解离均可被抑制。在四氢呋喃-甲醇（35∶65）中，二丁基二硫代氨基甲酸锌的HPLC峰易发生漂移，稳定性差；在四氢呋喃-乙腈（35∶65）中，二丁基二硫代氨基甲酸锌的HPLC峰稳定性良好。因此，选择四氢呋喃-乙腈（35∶65）作为流动相。

综上所述，确定优化HPLC测试条件为：色谱柱 SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，进样量 2 μL，流动相 四氢呋喃-乙腈（35∶65），流动相流速 1 mL·min-1，检测器 紫外线检测器，波长 254 nm。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性回归方程

精确称取37.5 mg二丁基二硫代氨基甲酸锌对照品，置于50 mL容量瓶中，用四氢呋喃-乙腈（10∶90）溶解并稀释定容至刻度，摇匀溶液，作为贮备液。

2.2.2 精密度

吸取适量贮备液，依次稀释为质量浓度为750，500，250 μg·mL-1的系列对照品溶液，分别取各对照品溶液2 μL进行测试，重复测试3次，结果见表1。

表1 精密度试验结果Tab.1 Precision test results

由表1可知，3种质量浓度的对照品溶液的谱峰面积的相对标准偏差均小于3%，表明测试精密度高。

2.2.3 稳定性

配制质量浓度为500 μg·mL-1的对照品溶液，分别在放置0，2，4，6 h时进行测试，记录HPLC峰面积。结果显示，这4个时间点测试的谱峰面积的相对标准偏差为1.6%，表明供试品溶液在6 h内稳定。

2.2.4 检出限和定量限

取质量浓度为20 μg·mL-1对照品溶液逐步稀释并进行检测，信噪比为10时得到定量限，信噪比为3时得到检出限。计算得出检出限为20 ng，定量限为30 ng。按二乙基二硫代氨基甲酸锌限量使用要求（≤1.5%），本方法检出限和定量限可满足检测要求。

2.2.5 回收率

药用胶塞经液氮脆化处理后，分别置于粉碎机中粉碎成末。称取胶塞样品置于锥形瓶中，平行制备9份（每份约350 mg）。每3份胶塞样品中分别加入约3，5，6 mg的二丁基二硫代氨基甲酸锌，然后加入10 mL四氢呋喃-乙腈（10∶90）超声提取60 min（分2次完成）。按优化色谱条件对提取液进样测试，计算回收率，结果见表2。

表2 回收率试验结果Tab.2 Recovery test results

由表2可知，高、中、低加标回收率试验的回收率在98.84%～102.58%范围内，平均回收率为101.03%，相对标准偏差为1.17%，表明本方法准确性良好。

2.3 药用胶塞检测

3批药用胶塞经液氮脆化处理后，分别置于粉碎机中粉碎成末。称取适量胶塞样品置于锥形瓶中，加入四氢呋喃-乙腈（10∶90）超声萃取60 min（分2次完成）。按上述建立的HPLC方法对提取液进行测试，即对3批药用胶塞样品中二丁基二硫代氨基甲酸锌的残留量进行测试。结果显示，3批药用胶塞中均未检出二丁基二硫代氨基甲酸锌。

2.4 适用性

金属螯合物的解离行为与HPLC行为密切相关。本研究在确认测试方法后，进一步探究了不同配体取代基对螯合物配合稳定性的影响。对3种硫代氨基甲酸锌盐（二丁基二硫代氨基甲酸锌、二乙基二硫代氨基甲酸锌和二甲基二硫代氨基甲酸锌）的解离行为进行了分析，发现其配体与金属离子的配合稳定性从高到低的顺序为二丁基二硫代氨基甲酸锌、二乙基二硫代氨基甲酸锌、二甲基二硫代氨基甲酸锌。其原因在于3种配体上取代基（丁基、乙基和甲基）的差异影响螯合物的稳定性。丁基、乙基和甲基为给电子基团，给电子能力越强的基团可给氮提供更充分的电子，从而使得配体的碱强度增大和螯合能力增强，有助于螯合物稳定。丁基、乙基和甲基的给电子能力顺序减弱，这与3种硫代氨基甲酸锌盐的配体与金属离子的配合稳定性高低顺序一致。

本研究建立的HPLC法还适用于二乙基二硫代氨基甲酸锌的定量分析，但不适用于二甲基二硫代氨基甲酸锌的定量分析，这表明对于配体与金属离子的配合相对稳定的金属螯合物，可通过抑制解离实现其HPLC分析，但对于配体与金属离子的配合稳定性较差的金属螯合物，很难通过抑制解离方式对其进行HPLC分析。

3 结论

本研究建立了HPLC法测定药用胶塞中二丁基二硫代氨基甲酸锌的残留量的方法，填补了当前该方面检测的空白。该方法简便、准确、灵敏、稳定，适用于二丁基二硫代氨基甲酸锌的分析和检测。实际药用胶塞产品检测证明该方法适用性良好。该方法为胶塞类药品包装材料的质量监测提供了有效的技术手段。