IL-33增强胃癌细胞顺铂抵抗的机制研究

谢先泽 樊俏玫 黄伟 翁娅韵 姚文栋 陈云云 施政

据统计，胃癌是男性第四大、女性第七大最常见的癌症，全球每年有超过100万的新病例。化疗可在一定程度上缓解患者病情，延长生存期，但由于耐药性和肿瘤转移，胃癌患者预后较差[1]，接受手术治疗的Ⅲ期胃癌患者5年生存率仅为18%～50%[2]。目前胃癌化疗仍然以传统的细胞毒性药物为主，但常由于药物无法有效控制肿瘤转移而导致患者死亡[3-4]。顺铂是胃癌，尤其是晚期胃癌的主要化疗药物，但由于长期使用，患者可出现耐药性，顺铂对肿瘤的抑制能力逐渐减弱，最终导致化疗失败[5]。随着对胃癌发生、发展分子机制的深入探索，靶向治疗已经成为胃癌有效的治疗方法。研究发现：自噬在胃癌的发展中起关键作用。在缺氧或营养的条件下，肿瘤细胞通过自噬降解衰老的细胞器或蛋白质来维持线粒体功能和能量平衡[6]。Zhuang等[7]发现：胃泌素17作用下胃癌细胞自噬增强，细胞增殖加快，其机制为胃泌素17诱导了自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1高表达。Zhao等[8]发现：miR-181a通过靶向自噬相关基因ATG5提高胃癌细胞对顺铂的敏感性，减少裸鼠异种移植胃癌组织的体积。可见，探索自噬相关机制已成为胃癌治疗的新方向。本研究通过分析IL-33对胃癌细胞的作用，阐明其功能和被调控的机制，为胃癌的早期诊断和判断预后提供新的候选靶标，为未来基于IL-33/生长刺激表达基因2蛋白（growth STimulation expressed gene 2,ST2）的基因治疗提供理论依据和实验基础。

1 材料和方法

1.1 细胞及来源 胃癌细胞MKN45细胞系（Cellbank-436）和胃癌旁正常胃上皮细胞GES-1（Cellbank-035）均购自浙江如耀生物科技有限公司。所有细胞在RPMI1640培养基（批号：L210KJ，上海源培生物公司）和10%FBS（批号：FBS500，上海源培生物公司）中培养，37 ℃、5% CO2，正常传代。

1.2 主要材料 四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（批号：C0009S）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0012S）、超敏电化学发光（enhanced chemiluminescence,ECL）试剂盒（批号：P0018S）均购自上海碧云天生物科技有限公司；依托泊苷（批号：E809313-25 mg）、5-氟尿嘧啶（批号：F809394-1 g）、阿霉素（批号：A864033-25 mg）及顺铂（批号：D807330-250 mg）均购自上海麦克林试剂有限公司；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA，批号：M129496-1 g）购自上海阿拉丁试剂有限公司；兔抗Beclin1抗体（批号：R1509-1）、兔抗微管相关蛋白1轻链 3α/β（LC3A/B）抗体（批号：ab128025）、ST2抗体（批号：ab25877）、兔抗β-微管蛋白（β-tubulin）抗体（批号：ab18207）和羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗（批号：ab6721）均购自英国Abcam公司；ST2抑制剂iST2-1（批号：DC12393）购自上海东苍生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 IL-33对MKN45和GES-1细胞增殖的影响 采用MTT法。在96孔板中接种MKN45和GES-1细胞，分别添加0、8、16、32、64、128和256 ng/L的IL-33，正常培养48 h；各样品加入0.5 g/L的MTT溶液，孵育4 h；加入100 μl二甲基亚砜溶解沉淀的甲臜，摇动15 min；测定每孔中细胞在波长570 nm处的吸光度，计算细胞增殖率。

1.3.2 IL-33作用下胃癌细胞对化疗药物敏感性的检测 采用MTT法。取对数生长期胃癌细胞，依次加入0、20、40、60和80 ng/L 的IL-33；分别添加10 μmol/L的依托泊苷（依托泊苷组）、5-氟尿嘧啶（5-氟尿嘧啶组）、阿霉素（阿霉素组）及顺铂（顺铂组），共培养48 h。计算细胞增殖率。

1.3.3 IL-33作用下胃癌细胞对顺铂及其抑制剂敏感性的检测 采用MTT法。取对数生长期胃癌细胞，依次加入 0、20、40、60和 80 ng/L 的 IL-33；设置顺铂组（样品中添加10 μmol/L顺铂）和自噬抑制剂组（样品中添加10 μmol/L顺铂，同时添加10 mmol/L的3-MA），共培养48 h。计算细胞增殖率。

1.3.4 IL-33对胃癌细胞自噬相关蛋白表达的影响 采用Western blot法。取对数生长期胃癌细胞，给予0、20、40和80 ng/L IL-33处理，提取细胞总蛋白并检测自噬相关蛋白Beclin1和LC3A/B。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离包含等量蛋白质的样品，电转移到聚偏氟乙烯膜上，并在4℃下用一抗孵育过夜。洗膜缓冲液洗涤后，加入二抗，室温下孵育1 h。检测到的蛋白带通过增强的ECL化学发光液曝光，并使用Image J软件进行评估，量化后的数值以β-tubulin为内参，计算Beclin1和LC3A/B相对表达量。

1.3.5 IL-33对胃癌细胞ST2表达的影响 取对数生长期胃癌细胞，给予10 μmol/L顺铂处理后，分成3组：即顺铂组，顺铂+IL33组（添加终质量为60 ng/L的IL-33）和顺铂+IL-33+iST-2组（添加终质量浓度为60 ng/L的IL-33和10 μmol/L的 iST2-1），以不添加任何试剂的胃癌细胞为空白对照组；分别在培养的第12、24、36和48 h收集细胞。采用MTT法检测并计算各组细胞增殖率。采用Western blot法检测Beclin1、LC3A/B和ST2的相对表达量。

1.4 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0绘图和统计软件，所有实验均重复3次。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同质量浓度IL-33对MKN45和GES-1细胞增殖影响的比较 不同质量浓度IL-33对GES-1细胞增殖影响不大；0、8、16、32、64 ng/L IL-33处理下，MKN45细胞增殖无大变化，IL-33质量浓度＞64 ng/L时，MKN45细胞增殖率上升，128 ng/L IL-33时增殖率为96.81%，256 ng/L IL-33时增值率为97.99%，与不添加IL-33相比差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 不同剂量IL-33对GES-1和MKN45细胞增殖影响的比较

2.2 IL-33作用下胃癌细胞对化疗药物敏感性的比较 阿霉素组胃癌细胞增殖率低，不同质量浓度IL-33处理的细胞增殖率变化不大；5-氟尿嘧啶组及依托泊苷培养组，不同IL-33质量浓度下细胞增殖率变化无统计学意义；顺铂培养组，60、80 ng/L IL-33处理与不添加IL-33（0 ng/L）相比，胃癌细胞增殖率均升高（均P＜0.05）。即在IL-33质量浓度≥60 ng/L时，胃癌细胞可能出现顺铂耐药性。见图2。

图2 不同质量浓度IL-33处理下，胃癌细胞对4种化疗药物敏感性的比较

2.3 IL-33处理下胃癌细胞对顺铂及自噬抑制剂敏感性的比较 顺铂组，IL-33处理下胃癌细胞增殖率上升，即IL-33可能促进了胃癌细胞的增殖；给予自噬抑制剂3-MA后，20、40、80 ng/L IL-33处理下胃癌细胞增殖率降低，差异有统计学意义（P＜0.05），可见3-MA有逆转IL-33对胃癌细胞增殖的作用。见图3。

图3 IL-33对顺铂及自噬抑制剂共培养的胃癌细胞增殖率的影响

2.4 不同质量浓度IL-33对胃癌细胞自噬相关蛋白表达的影响 与0 ng/L IL-33组比较 ，20、40、80 ng/L的IL-33处理胃癌细胞，自噬相关蛋白LC3A/B和Beclin1的相对表达量显著上升，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

图4 IL-33对胃癌细胞自噬相关蛋白表达的影响（a：自噬相关蛋白电泳图；b：Beclin蛋白的相对表达量；c：LC3A/B蛋白的相对表达量）

2.5 IL-33对胃癌细胞ST2表达的影响 顺铂组，胃癌细胞增殖率在24 h时最高；顺铂+IL-33组，细胞增殖率持续上升，36 h时才达到最高值；至培养的第36 h开始，顺铂+IL-33+iST2-1组与顺铂＋IL33组细胞增殖率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5a。提示iST2-1逆转了IL-33对顺铂处理的胃癌细胞增殖率的抑制作用。Western blot检测结果显示：与对照组比较，顺铂+IL33组LC3A/B及Beclin1蛋白相对表达量提高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；顺铂组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，顺铂+IL33组ST2蛋白相对表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与顺铂+IL33组比较，顺铂+IL-33+iST-2组ST2蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。可见ST2的抑制剂iST2-1能够有效逆转胃癌细胞自噬蛋白的提高，见图5b-c。

图5 IL-33对胃癌细胞ST2及自噬相关蛋白表达的影响（a：4组细胞增殖率；b：ST2和自噬相关蛋白电泳图；c：ST2和自噬相关蛋白的相对表达量）

3 讨论

IL-33是IL-1细胞因子家族的新成员[9]，在免疫细胞、胃、肺和前列腺等不同组织中都有表达，生物学活性广泛；除可以活化Th1，Th2，CD8+T细胞和自然杀伤细胞（NK）等细胞外，IL-33还被认为是一种损伤相关分子模式分子[10]，在组织修复、变态反应、自身免疫性疾病、感染性疾病和癌症中发挥重要作用[11]。本研究用不同质量浓度IL-33处理胃癌细胞和胃上皮细胞，结果发现：高剂量IL-33提高了胃癌细胞增殖率，这提示IL-33的存在可能对胃癌具有促进作用。顺铂是胃癌治疗的经典药物，本研究发现：不同质量浓度IL-33处理下，与顺铂共培养的胃癌细胞增殖率上升，这提示IL-33能提高胃癌细胞的顺铂耐药性，即IL-33诱导了胃癌细胞对化疗药物的抵抗。

自噬受一系列自噬相关基因的严格调控，是至关重要的细胞内稳态过程，通常在不利的微环境压力下激活[12]。在饥饿、缺氧或其他特定的细胞应激条件（如化疗药物等）下，有缺陷的蛋白质和细胞器可通过该过程降解和再循环来应对压力，为肿瘤细胞生长提供有利条件。自噬被激活能够介导化疗中某些癌细胞获得性耐药表型。研究表明：上调不同肿瘤细胞系的自噬会增强肿瘤对包括放射疗法、化学疗法和靶向疗法在内的抗癌疗法的抵抗力[13]。对胃癌细胞的顺铂耐药性研究表明：抑制甲基转移酶介导的自噬抑制作用能够降低胃癌细胞的顺铂敏感性[14]。这说明自噬可能在胃癌细胞顺铂耐药中发挥重要作用。自噬抑制可以使以前耐药的癌细胞重新敏感，并增加化学治疗剂的细胞毒性[14-15]。本研究检测了自噬相关蛋白Beclin1和LC3A/B的表达量，结果发现：IL-33处理下，胃癌细胞自噬相关蛋白出现高表达，提示IL-33激活自噬；给予自噬抑制剂3-MA后，这些自噬相关蛋白相对表达量显著下降。证实了IL-33处理下胃癌细胞通过自噬产生顺铂耐药，而3-MA能有效逆转IL-33作用下的胃癌细胞顺铂耐药。

IL-33通过与特异性受体ST2结合后发挥功能。Zhou等[16]指出：肿瘤细胞与激活的成纤维细胞在TNF-α/IL-33/膜结合受体形式的ST2（ST2L）信号介导下相互作用，促进胃癌转移。IL-33通过ST2-蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2）通路促进胃癌细胞侵袭和迁移[16]。Huang等[17]研究表明：ST2在胃癌组织中高表达。IL-33/ST2通过诱导细胞外调节ERK1/2、氨基末端激酶（c-Jun N-terminal protein kainse,JNK）和激活p38蛋白，促进了胃癌细胞的恶性进展。因此，IL-33/ST2通路在胃癌进展过程中发挥极其重要作用。本研究表明：IL-33处理后，顺铂诱导的胃癌细胞ST2出现显著上调，给予iST2-1显著降低ST2的蛋白相对表达量。检测自噬相关蛋白的表达量可见：在ST2抑制后，LC3A/B与Beclin1也随即出现下调；结合MTT结果表明：胃癌细胞对顺铂的敏感性随着ST2的抑制显著增加。即IL-33极有可能是通过靶向ST2来介导胃癌细胞自噬从而产生顺铂耐药。

综上所述，本研究观测了IL-33作用下胃上皮细胞与胃癌细胞的增殖率，发现IL-33可促进胃癌细胞生长；IL-33影响下胃癌细胞对化疗药顺铂产生耐药效应，其机制是IL-33可诱导自噬发生，增强胃癌细胞对顺铂的抵抗；ST2的抑制可逆转IL-33带来的自噬激活及顺铂耐药效应。IL-33/ST2途径可为胃癌顺铂耐药导致的治疗失败提供新的治疗靶点及方向。