人脱细胞羊膜移植预防内镜黏膜下剥离术后食管狭窄的临床评估

胡柯峰 朱春霞 李琪儿 金燕平 刘青青 竺亚斌 叶国良

内镜黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection,ESD）后食管狭窄是一种良性的、复杂性食管狭窄。目前研究发现术后食管黏膜环周缺损是导致食管狭窄的主要危险因素，食管3/4环周及以上的病变者ESD后狭窄发生率为70%～90%[1]；食管全环周病变者ESD后狭窄发生率近乎100%[2]。患者发生食管狭窄，主要表现为吞咽困难，严重者甚至无法进食，明显影响生活质量。因此，大面积ESD后，尤其是食管≥3/4环周病变者ESD后食管狭窄的预防有重要临床意义。当前ESD后食管狭窄的预防措施包括药物、机械性扩张、再生医学等，具有一定效果。脱细胞组织基质（acellular tissue matrix,ATM）是近年来在组织修复领域的热门话题，笔者团队尝试应用人脱细胞羊膜（human acellular amniotic membrane，HAAM）移植来预防食管≥3/4环周病变者ESD后食管狭窄，安全可行，效果满意，现报道如下，以供同行参考。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2011年6月—2021年12月宁波大学医学院附属医院收治的行ESD治疗的早期食管癌患者53例。所有患者根据临床表现、染色内镜、放大内镜、超声内镜、病理及影像学等检查确诊为大面积（≥3/4环周）早期食管癌并符合ESD治疗适应证。排除标准：（1）病变＜3/4环周；（2）肿瘤已经侵及黏膜下层深部；（3）术前检查发现有淋巴结转移；（4）任何原因无法口服或中断口服强的松；（5）ESD后追加食管外科手术者；（6）存在凝血功能障碍者；（7）合并严重的心肺疾病不能耐受ESD；（8）未签署治疗知情同意书者。其中2011年6月—2016年6月收治的26例患者行常规ESD治疗（对照组），2016年7月—2018年12月收治的14例患者行ESD并术后口服强的松治疗（激素组），2019年1月—2021年12月收治的13例患者行ESD并创面移植HAAM治疗（试验组）。HAAM由宁波大学医学院竺亚斌教授团队提供，由废弃人羊膜制备。试验组患者男11例，女2例；年龄（61.92±8.23）岁。激素组患者男11例，女3例；年龄（64.71±7.66）岁。对照组患者男21例，女5例；年龄（64.31±9.02）岁。3组患者病灶位置均主要位于食管中下段，试验组食管中下段病变占69.23%，激素组占71.43%，对照组占73.08%。所有病灶内镜下均表现为平坦型，病灶横径均≥3/4环周。病灶纵向长度方面，试验组为（5.07±1.91）cm，激素组为（4.96±1.57）cm，对照组为（5.18±2.03）cm。3组患者性别、年龄、病灶位置及大小等比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。所有患者均在术前签署知情同意书。本研究通过宁波大学医学院附属医院伦理委员会审查（批件号：KY20190101）。

1.2 方法

1.2.1 术前准备 患者术前禁食12 h；完善术前相关检查，包括心电图、胸部CT、血常规、凝血功能、肝肾功能、电解质、血糖、血型、输血前检查等。

1.2.2 器械 日本Olympus公司GIF-Q260J治疗胃镜、GIF-H260Z放大胃镜；德国ERBE公司VIO200D电外科工作站；日本Olympus公司CO2送气泵及冲水泵；日本Olympus公司的KD-650Q Dual刀、KD-612L IT刀、FD-410LR/411QR止血钳、NM-200L-0423注射针；南京微创医学科技股份有限公司SHXROCC-D-26-195组织夹，杭州安瑞医疗器械有限公司AMH-HCG-195-135组织夹，日本Olympus公司D-201-11804透明帽。

1.2.3 操作方法 所有患者均行气管插管全身麻醉，主要步骤：（1）胃镜观察病灶位置，窄带成像技术（narrow band imaging,NBI）联合放大内镜，按照日本食管学会分型[3]中食管上皮乳头内毛细血管袢（intraepithelial capillary loop,IPCL）的AB分型对所有病灶进行分型并记录，再予卢戈碘液对病灶染色，并记录病变纵向长度和环周范围；（2）ESD过程：包括标记、黏膜下注射、黏膜切开、黏膜下剥离、创面处理；（3）试验组将HAAM材料剪成每张约1.5～3.0 cm2大小，予金属夹钳夹住并随内镜送至ESD创面，内镜直视下将其展平，并予金属夹将HAAM四边固定于创面，每个创面移植1～3张HAAM。试验组典型患者内镜下所见见图1（插页）。

图1 HAAM移植预防大面积（≥3/4环周）早期食管癌ESD后食管狭窄典型患者内镜下所见（a：胃镜发现食管中段黏膜大片发红，表面轻度高低不平，血管纹理不清，病变超过3/4环周；b：NBI观察，病灶呈茶褐色改变，边界清楚；c：NBI放大内镜观察，病灶处IPCL呈B1型，未见明显乏血管区；d：卢戈碘液染色后病灶区域显示更加清晰；e：ESD创面，仅存图中12点钟处一条状正常黏膜；f、g：HAAM材料覆盖创面，并予多枚金属夹固定于正常黏膜；h：ESD术后3个月复查胃镜，创面瘢痕形成，未见明显狭窄；i：ESD术后1年复查，创面瘢痕形成，轻度狭窄，普通内镜通过顺利，患者无吞咽困难表现）

1.2.4 术后处理和随访 患者术后心电监护、禁食，常规应用质子泵抑制剂及补液，术后24 h开始低温流质饮食，逐步过渡到半流质饮食，继续口服质子泵抑制剂、黏膜保护剂等共8周。由于过早进食会导致HAAM提早脱落影响移植效果，试验组所有患者术后禁食72 h，72 h后开始低温流质饮食4 d，其余处理同对照组。激素组患者术后第3天开始口服强的松30 mg/d，并规律减量（第1～8周用量分别为30、30、25、25、20、15、10、5 mg/d），总疗程8周。观察3组患者胸闷、胸痛、咳嗽、腹痛、体温等情况，及有无消化道出血。术后第3、6、12个月复查胃镜了解创面愈合情况及食管狭窄发生情况。

1.2.5 内镜下扩张治疗 若随访过程中患者出现吞咽困难，立即复查胃镜并根据内镜下表现决定是否行扩张治疗。首选内镜下球囊扩张（endoscopic balloon dilation,EBD）或探条扩张，扩张周期因人而异，直至患者吞咽困难症状缓解。若上述扩张治疗效果不理想，亦可选择全覆膜可回收食管支架置入术。

1.3 观察指标 （1）手术时间：指病灶标记至病灶切下后创面处理所耗时间，试验组包括HAAM移植所耗时间。（2）并发症：包括术中出血及迟发性出血、术中穿孔及迟发性穿孔、纵隔感染等。（3）术后病理检查结果。（4）主要观察指标：食管狭窄及顽固性狭窄发生率。食管狭窄定义为内镜下评估狭窄部的直径＜1 cm，或常规型号镜身（直径约1 cm）不能通过，常伴有不同程度的吞咽困难。顽固性食管狭窄定义为每2周进行1次内镜下扩张治疗，连续进行5次，标准内镜仍不能通过狭窄部位或再次诊断食管狭窄[4]。（5）需内镜下扩张治疗次数。（6）吞咽困难缓解率，吞咽困难程度按Stooler标准分为5级，0级：吞咽正常；Ⅰ级：偶尔发生吞咽困难，能进软食；Ⅱ级：能进半流质饮食；Ⅲ级：仅能进流质饮食；Ⅳ级：完全不能进食，饮水困难。吞咽困难缓解标准为患者的吞咽困难恢复至0～Ⅰ级，标准胃镜通过无阻力，且继续随访8周无狭窄发生[4]。

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析。计数资料以频数和构成比表示，多组比较采用χ2检验，组间两两比较采用χ2分割法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者手术情况比较 3组患者ESD及相关治疗均成功，试验组患者手术时间为（95.82±11.21）min，较对照组[（90.16±21.08）min]和激素组[（87.31±19.57）min]长，但差异无统计学意义（P＞0.05）。3组患者均未发生迟发性出血、穿孔及纵隔感染等与内镜治疗相关的严重并发症，无死亡。

2.2 3组患者术后病理检查结果比较 试验组患者术后病理检查诊断为M1（病变局限于上皮层）4例（30.77%），M2（病变侵犯至黏膜固有层）6例（46.15%），M3（病变侵犯至黏膜肌层）3例（23.08%），SM1（病变侵犯至黏膜下层的上1/3，深度距黏膜肌层下缘＜200 μm）0例，SM2（病变侵犯至黏膜下层的中层）0例；激素组：M1 3例（21.43%），M2 6例（42.86%），M3 4例（28.57%），SM1 1例（7.14%），SM2 0例。对照组：M1 10例（38.46%），M2 9例（34.62），M3 4例（15.38%），SM1 2例（7.69%），SM2 1例（3.85%）。3组患者术后病理检查结果比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 3组患者术后食管狭窄、顽固性狭窄发生率比较试验组患者术后食管狭窄发生率为23.08%（3/13），激素组为28.57%（4/14），对照组为65.38%（17/26），试验组食管狭窄发生率低于对照组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；试验组和激素组的食管狭窄发生率相当，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

试验组仅1例早期食管癌合并原发性肝癌患者发生顽固性食管狭窄，ESD后创面环食管9/10周，予HAAM移植+食管支架置入，2周后行肝癌切除术，1个月后出现吞咽困难，发现支架移位，予取出，术后14个月内因食管狭窄共行EBD 8次，再次置入食管支架1次（该支架置入2个月后取出，再发狭窄），内镜下切开2次，后未再发食管狭窄，截至本文收稿时病情稳定。试验组患者顽固性狭窄发生率（7.69%，1/13）低于对照组（26.92%，7/26），但两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；试验组和激素组（7.14%，1/14）顽固性狭窄发生率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 3组患者术后需内镜下扩张治疗次数比较 试验组2例非顽固性食管狭窄患者需内镜下扩张治疗（1.50±0.50）次，激素组3例非顽固性食管狭窄患者需内镜下扩张治疗（1.67±0.47）次，而对照组10例患者需内镜下扩张治疗（3.80±0.98）次。试验组、激素组非顽固性食管狭窄患者需内镜下扩张次数均比对照组少（均P＜0.05）；试验组与激素组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 3组患者术后吞咽困难缓解率比较 术后随访3～58个月，平均30.2个月。3组患者经治疗后吞咽困难程度均恢复至0～Ⅰ级，复查胃镜提示食管轻度狭窄或无明显食管狭窄，吞咽困难缓解率均为100.0%（P＞0.05）。

3 讨论

ESD是近年兴起的内镜微创切除技术，已成为治疗早期消化道癌及癌前病变的标准治疗方法之一。ESD后创面愈合是机体自身修复机制综合作用的结果，但在客观上引起了食管狭窄和食管壁纤维化[5]。ESD后食管狭窄是一种良性的、复杂性食管狭窄，目前研究发现术后食管黏膜环周缺损是导致食管狭窄的主要危险因素。食管缺损范围＜1/2环周时狭窄发生率低，不需要采取预防术后狭窄的措施[6]；缺损范围1/2～3/4环周时ESD后狭窄发生率相对较低，约11.5%，其狭窄的发生与病变位置有关，食管上段病变更易发生[7]；而3/4环周及以上的病变ESD后狭窄发生率会上升至70%～90%；食管全周病变ESD者，术后食管狭窄率近乎100%。因此对于≥3/4环周病变ESD后食管狭窄的预防具有重要意义。

预防ESD后食管狭窄的主要药物为糖皮质激素。口服糖皮质激素能够有效预防ESD后的食管狭窄。但全身应用糖皮质激素在部分患者中存在一定禁忌，且有诱发或加重高血压和糖尿病、免疫抑制、骨质疏松等不良反应。Takahashi等[8]研究发现，内镜下预防性注射糖皮质激素可明显降低ESD术后食管狭窄的发生率，减轻狭窄程度，减少术后扩张治疗次数。但直接对黏膜下层注射糖皮质激素，存在技术难度，且可能会增加食管狭窄后EBD治疗的穿孔风险[9]。

机械性扩张包括预防性内镜下球囊扩张EBD或临时支架置入。预防性EBD常需反复多次进行[10-11]，既增加了治疗风险，也增加了患者的负担和痛苦，与微创治疗的初衷相悖。而临时食管支架置入存在支架移位和支架取出后再狭窄等问题，这两个并发症同时出现于本研究试验组顽固性狭窄的病例。

近年来，再生医学在预防ESD后食管狭窄方面也有一些探索，文献报道的主要方法为自体细胞移植和细胞膜片移植等，均获得了一定成功。但自体细胞离体培养数量有限、耗时且利用率低，因而难以在临床推广。

ATM是通过物理、化学等方法对来源于动物（异种）或人类（异体）的组织进行脱细胞处理，去除移植相关抗原，仅保留含胶原网架的细胞外基质，从而获得的一种具有一定生物活性的生物衍生材料。羊膜位于胎盘的最内层，厚度20～50 μm，由上皮、基底膜、致密层、成纤维细胞层、海绵层5层结构组成。HAAM作为一种特殊的细胞外基质，保留了生物活性成分，包括转化生长因子β1、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子，以及基底膜的纤维网状结构[12]。由于人羊膜来源丰富、获取方便，并且具有良好的生物相容性、免疫调节及抗炎、抗菌、抗纤维化等优点[13]，自1910年首次用于皮肤移植以来，特别是1995年以来，关于其在组织工程中的应用报道越来越多，目前被广泛应用于临床各种损伤部位的修复，如角膜、皮肤、骨及软组织、外周神经[13-16]等。2017年Han等[17]首先报道，将猪的自体ATM移植到食管ESD后黏膜缺损处，实验动物均未发生有明显症状的食管狭窄，术后4周可见缺损部位出现完全性黏膜上皮、轻微的炎症反应及规则的胶原纤维形成，这为ESD后食管狭窄的预防开辟了新的方向。新近，Dolezel等[18]对猪行全周切除的ESD创面给予包括支架、糖皮质激素及ATM膜片中两种或多种措施联合的方法来预防食管狭窄，结果发现：ATM膜片联合支架组可降低食管狭窄严重程度，并可提高创面愈合质量。目前国内外对HAAM材料预防ESD后食管狭窄的临床研究鲜见。本研究应用的HAAM由废弃人羊膜制备，获得浙江省医疗器械检验研究院认证，无细胞毒性及抗原性，并在皮肤外科临床个例应用中已获得显效。因此，笔者团队进行了HAAM材料预防≥3/4环周病变ESD后食管狭窄的临床初步探索。

本研究对13例≥3/4环周病变早期食管癌患者行ESD治疗，并对创面移植HAAM，取得满意疗效，达到与口服糖皮质激素类似的疗效，但无激素相关不良反应，显示出了HAAM预防大面积（≥3/4环周）早期食管癌ESD后食管狭窄的独特优势，可能具有一定的临床应用前景。但是本研究仍存在较多值得进一步探讨之处：（1）HAAM固定方法，笔者团队采用金属钛夹固定的方法，但由于操作空间小，如何展平HAAM薄片并良好固定，存在操作难度，且钛夹有短期内脱落风险；（2）HAAM薄片移植密度，是否整个创面完全覆盖，或仅覆盖部分创面；（3）术后患者进食时间，进食过早可导致HAAM提早脱落，进食过晚会影响患者生活质量。此外，本研究样本量较小，随访时间较短，仍需要高质量、随机、大样本的前瞻性研究来证实其短期和长期的有效性和安全性。