枯草芽胞杆菌发酵制备南极磷虾肽及其体外抗氧化活性研究

杨柳，郑汉丰，郭全友，杨絮，周国燕，郑尧

1(中国水产科学研究院 东海水产研究所，上海，200090)2(上海理工大学 健康科学与工程学院，上海，200093)

南极磷虾(Euphausiasuperba)，生物资源量大，约6.5亿～10.0亿t，其营养价值高，被誉为“人类未来的动物蛋白库”。20世纪60年代起，南极磷虾成为各国战略争夺资源，挪威、中国、智利、日本等是主要捕捞及加工国家[1]。目前，南极磷虾以冻虾和虾粉等产品形式为主。南极磷虾富含内源酶，易使虾体发生自溶，导致品质下降。磷虾经蒸煮、分离和干燥等工艺生产的虾粉，由于内源酶失活和水分含量降低，易于运输和贮存，南极磷虾粉的船上加工和全效利用成为关注重点。

南极磷虾粉富含蛋白质、虾青素、磷脂脂肪酸等成分[2]，多用于磷虾油提取[3]。提油后的脱脂虾粉中含有大量优质蛋白，制备具有抗氧化、降血压等功能活性的磷虾肽受到业内关注[4-5]。蛋白肽制备多用酶解与发酵法[6]，但酶解所得蛋白肽多含疏水性氨基酸，苦味明显[7]，而微生物发酵产生的有机酸对苦味有掩盖作用、外肽酶具有脱苦功效[8]，所得多肽风味更佳，适口性更强。同时，生物酶价格昂贵，酶解法在工业应用受到限制，因此，微生物发酵法成为一种天然绿色的多肽制备方法。

枯草芽胞杆菌是发酵制备多肽的安全菌种之一，具有产酶丰富、生长迅速等特点，在食品工业领域应用广泛[9]。除选择合适的菌株以最大限度地提高目标产物的产量外，发酵时间、初始接种量等发酵条件同样影响发酵效能[10]。抗氧化是蛋白肽最主要的生物活性，自由基清除率、还原力等能有效评价蛋白肽的抗氧化活性。目前，以南极磷虾粉为原料，发酵制备多肽的研究报道较少。

本文选择枯草芽胞杆菌为发酵菌种，针对料液比、发酵时间、初始接种量等因素进行优化，并进行正交试验。选择自由基清除率、亚铁离子螯合力及总抗氧化力对两种工艺制备的南极磷虾粗多肽体外抗氧化活性进行评价。为提高南极磷虾多肽的发酵效能和抗氧化活性等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾粉购自中国水产有限公司，运至实验室后均于-20 ℃冷冻保藏。

枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)CICC 10071购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，运至实验室活化后采用甘油保藏，于-80 ℃冷冻保藏。

95%乙醇，上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醛溶液、氢氧化钠标准溶液(0.05 mol/L)，上海麦克林生化科技有限公司；牛血清蛋白，美国Sigma公司；LB固体培养基、LB液体培养基，北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KDN-103F凯氏定氮仪，上海纤检仪器有限公司；LRH-250恒温培养箱、DK-8D恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；ZHWY-100H/200H恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；UV9100紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科有限公司；SPARK 10M多功能酶标仪，奥地利Tecan有限公司；2011-B6236立式灭菌锅，上海东亚压力容器制造有限公司；Avanti J-301低温高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵工艺流程

发酵工艺流程如下：

原料→脱脂→灭菌→发酵→离心、抽滤→灭酶→取上清液待测

脱脂：95%乙醇，1∶10(g∶mL)1 000 r/min搅拌8 h，静置过滤，取沉淀，50 ℃烘干24 h，研钵研碎，于-18 ℃冷冻保藏。灭菌：按一定料液比称取脱脂虾粉于250 mL锥形瓶中，加入100 mL去离子水，调节pH值，于121 ℃灭菌15 min，超净台中冷却至室温待用。发酵：按比例接入一定量的枯草芽胞杆菌于灭菌虾粉中，采用30 ℃于恒温培养振荡器中发酵一定时间，设置转速为180 r/min。离心、抽滤：发酵结束后，取发酵液8 000 r/min离心15 min，取上清抽滤待用。灭酶：将离心、抽滤后的发酵液于95 ℃灭酶15 min。

1.3.2 菌株复活与保藏

取LB液体培养基0.5 mL完全溶解冻干菌粉后，转移至装有5 mL LB液体培养基的试管中混匀，30 ℃静置培养48 h，连续接种3代至菌株活力正常。转接至1.5 mL离心管，采用甘油保藏菌株，于-80 ℃保藏备用。

1.3.3 菌株活化及种子液制备

1.3.3.1 菌株活化

取1.5 mL离心管甘油保藏菌株，转接至100 mL LB液体培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养24 h，划线转接于LB固体培养基上，30 ℃培养48 h备用。

1.3.3.2 种子液制备

称取3 g脱脂虾粉于250 mL锥形瓶中，加入100 mL去离子水，于121 ℃灭菌15 min，超净台中冷却至室温，挑取单个菌落接种于灭菌虾粉中，30 ℃、180 r/min摇床培养48 h，测定菌液浓度，选择菌液浓度达109CFU/mL的种子液备用。

1.3.4 发酵工艺优化试验

1.3.4.1 单因素试验

依据前期预研结果，分别探究料液比[1∶100、3∶100、5∶100、7∶100、9∶100(g∶mL)]、发酵时间(1、2、3、4、5 d)、初始接种量(1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108CFU/mL)、发酵液初始pH值(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)对南极磷虾肽制备效果的影响。发酵结束后经离心、抽滤、灭酶后，取适量上清液备用，进行多肽得率、水解度及蛋白回收率的测定。

1.3.4.2 正交试验

根据单因素试验优化结果，进行L9(34)正交试验，对发酵时间、料液比和初始接种量3个因素进行优化，确定南极磷虾蛋白肽制备的最佳工艺。正交因素及水平设计如表1所示。

表1 正交试验设计L9(34)因素及水平Table 1 Independent variables and their levels chosen for L9 (34) orthogonal array design

1.4 指标的测定

1.4.1 枯草芽胞杆菌活菌数的测定

选择LB固体培养基，使用稀释涂布平板法，将已涂布的平板倒置，于30 ℃培养24 h后计数，以对种子液中枯草芽胞杆菌活菌数进行测定。

1.4.2 多肽得率的测定

使用双缩脲法对多肽得率进行测定。取0.6 mL发酵上清液，加入0.6 mL 三氯乙酸溶液(100 g/L)，混匀后静置10 min后，6 000 r/min离心15 min，取上清液1 mL于试管中，加入4 mL双缩脲试剂，混匀后静置60 min，于540 nm处测定吸光度。以1 mL去离子水代替样品做参比，牛血清蛋白为标准品，测定标准曲线，由标准曲线计算得多肽质量浓度。多肽得率的计算如公式(1)所示：

(1)

式中：c为发酵液多肽质量浓度，mg/mL；v为发酵液体积，mL；m为脱脂虾粉质量，g。

1.4.3 水解度的测定

水解度是反映蛋白水解过程中肽键的断裂情况，是衡量蛋白水解程度的重要指标。发酵液中氨基酸态氮含量使用甲醛电位滴定法测定[11]；原料中总氮含量参照GB 5009.5—2016，使用凯氏定氮法测定。水解度的计算如公式(2)所示：

(2)

式中：m1为发酵液中氨基酸态氮含量，g；m2为脱脂虾粉中总氮含量，g。

1.4.4 蛋白回收率的测定

蛋白质回收率是指发酵上清液中可溶性蛋白与原料总蛋白的百分比，用于表征发酵过程中菌株分泌蛋白酶对原料蛋白质的利用效率。参照GB 5009.5—2016，使用凯氏定氮法，测定发酵上清液与脱脂虾粉中的总氮含量。蛋白回收率的计算如公式(3)所示：

(3)

式中：ω1为发酵上清液总氮含量，g/100g；ω2为脱脂虾粉总氮含量，g/100g；m1为发酵上清液质量，g；m2为脱脂虾粉质量，g。

1.4.5 体外抗氧化活性

1.4.5.1 自由基清除率

(1)DPPH自由基清除率

参照CHEN等[12]的方法，稍作修改。将发酵液冻干后，分别配制质量浓度为1、2、3、4、5 mg/mL多肽样液，取1 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L，甲醇溶解)，与1 mL样液混合，室温下避光静置30 min，于517 nm处测得吸光度，以维生素C为阳性对照。DPPH 自由基清除率的计算如公式(4)所示：

(4)

式中：A1为待发酵液吸光度；A0为超纯水代替发酵液测得的吸光度；A2为甲醇代替DPPH溶液测得的吸光度。

(2)ABTS阳离子自由基清除率

参照KETNAWA等[13]的方法，稍作修改。ABTS母液(7 mmol/L ABTS、2.45 mmol/L过硫酸钾混合)，于室温避光反应16 h，用甲醇稀释ABTS母液，使其吸光值在734 nm处为0.7±0.02。将发酵液冻干后，分别配制质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的多肽样液。将样液与ABTS溶液1∶3混合，室温下避光反应6 min，于734 nm处测定吸光值，以维生素C为阳性对照。ABTS阳离子自由基清除率的计算如公式(5)所示：

(5)

式中：A1为待发酵液吸光度；A0为超纯水代替发酵液测得的吸光度；A2为甲醇代替ABTS溶液测得的吸光度。

(3)羟自由基清除率

参照陈丽花等[14]的方法，将发酵液冻干后，分别配制质量浓度为1、2、3、4、5 mg/mL多肽样液，取1 mL样液，加入1 mL硫酸亚铁溶液(6 mmol/L)、1 mL 过氧化氢溶液(6 mmol/L)，混匀后静置反应10 min，加入1 mL水杨酸溶液(6 mmol/L)混匀，室温下静置30 min，于510 nm处测定吸光度，以维生素C为阳性对照。羟自由基清除率计算如公式(6)所示：

(6)

式中：A1为待发酵液吸光度；A0为超纯水代替发酵液测得的吸光度；A2为超纯水代替水杨酸测得的吸光度。

1.4.5.2 亚铁离子螯合力

参照SUN等[15]的方法，将发酵液冻干后，分别配制质量浓度为1、2、3、4、5 mg/mL多肽样液。取5 mL样液，再加入0.1 mL氯化亚铁溶液(2 mmol/L)和0.2 mL菲洛嗪溶液(5 mmol/L)，混匀后反应10 min，于562 nm处测定吸光度，以维生素C为阳性对照。亚铁离子螯合力的计算如公式(7)所示：

(7)

式中：A1为待发酵液吸光度；A0为超纯水代替发酵液测得的吸光度。

1.4.5.3 总抗氧化能力

将发酵液冻干后，分别配制质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL多肽样液，使用总抗氧化能力[铁离子还原能力(ferric reduction ability plasma assay，FRAP)]试剂盒对发酵液的还原力进行测定，以维生素C为阳性对照。

1.5 数据统计与分析

使用SPSS 26.0软件进行单因素试验数据处理及显著性分析(P<0.05)，使用GraphPad Prism 7.0作图，使用minitab进行正交试验设计及数据分析。

2 结果与分析

2.1 发酵条件单因素试验

2.1.1 发酵时间的确定

时间对微生物生长代谢有显著影响。如图1所示，随发酵时间的增长，多肽得率先增后降，水解度和蛋白回收率均呈上升趋势。随发酵时间的增长，菌株进入衰亡期，产酶量下降，同时发酵体系中多肽被进一步水解为氨基酸，因此发酵后期多肽得率出现下降[16]。水解度反映肽键断裂的程度，随发酵时间的增长，发酵体系中的蛋白酶总量逐渐增多，因此水解度呈上升趋势，这与WANG等[17]的研究结果一致。水解度高说明发酵体系中小分子物质浓度升高，影响蛋白酶对底物蛋白的利用效率，因此蛋白回收率最终趋于平缓。结合实际情况，发酵时间过长不利于工业生产，能耗高成本大，因此选择1～3 d为后续正交试验范围。

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率图1 发酵时间对南极磷虾粉的影响Fig.1 Effect of fermentation time on Antarctic krill powder注：不同字母上标表示差异显著(P<0.05)(图2～图4同)

2.1.2 料液比的确定

料液比是限制发酵效能的关键因素[18]。如图2所示，随料液比的升高，发酵液中多肽得率呈现先增后减的趋势，水解度先快速增长后趋于平稳，蛋白回收率则随料液比的升高而下降。当料液比较低时，菌株因营养不足而生长缓慢，分泌蛋白酶较少，不利于蛋白水解。随料液比增高，菌株因营养充足而生长迅速，发酵体系中蛋白酶丰富，蛋白水解程度增高。但当料液比过高时，大量蛋白酶使体系中的多肽进一步降解为小肽与氨基酸，导致多肽得率下降而水解度仍呈增长趋势。蛋白回收率呈现完全相反的变化趋势，说明发酵过程中菌株所分泌的蛋白酶对底物的利用率不高，底物蛋白并未得到完全利用[19]。因此选择料液比1∶100～5∶100(g∶mL)进行后续正交试验。

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率图2 料液比对南极磷虾粉的影响Fig.2 Effect of material liquid ratio on Antarctic krill powder

2.1.3 初始接种量的确定

适宜的接种量可以提高发酵速度，有效节约时间和成本。如图3所示，多肽得率随接种量的增多而先增后减，水解度与蛋白回收率则呈上升趋势。当接种量较低时，发酵体系中微生物浓度过低，产酶量有限，底物蛋白水解程度低，发酵液中多肽含量少。当接种量过高时，底物营养不足，微生物生长受限，发酵体系中的多肽优先用于微生物生长，多肽得率下降。水解度随接种量的升高而升高，最终趋于平稳，同时蛋白回收率呈上升趋势，说明底物蛋白充足，发酵体系中的蛋白酶含量与底物蛋白浓度达到平衡状态。综合考虑，选择接种量1.5×106～1.5×108CFU/mL进行后续正交试验。

2.1.4 初始pH的确定

pH会影响微生物对底物的利用及其分泌蛋白酶的活性，从而影响发酵效率，因此需对发酵的初始pH进行确定。如图4所示，随初始pH的升高，多肽得率与水解度呈先增后减的趋势，蛋白回收率缓慢升高。pH的改变使多肽得率有所变化，但各组间并不存在显著差异。枯草芽胞杆菌在发酵过程中主要分泌的蛋白酶为碱性蛋白酶，因此当处于碱性环境时水解度与蛋白回收率更高。由图5可知，pH对发酵效能影响不大，且原始pH在7.0～8.0，因此在后续正交试验中不需对此因素进行优化，选择原始pH即可。

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率图3 接种量对南极磷虾粉的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on Antarctic krill powder

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率图4 初始pH对南极磷虾粉的影响Fig.4 Effect of initial pH on Antarctic krill powder

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，选择发酵时间(A)、料液比(B)及初始接种量(C)为因素，以多肽得率、水解度、蛋白回收率为指标，进行三因素三水平正交试验，优化南极磷虾粉的发酵工艺，结果如表2所示。

由极差可知，发酵条件对多肽得率的影响主次顺序依次为：C>A>B，发酵条件对水解度的影响主次顺序依次为：A>B>C，发酵条件对蛋白回收率的影响主次顺序依次为：B>C>A。由k值可知，对多肽得率和水解度而言，最佳发酵条件为A3B2C3，即发酵时间3 d、料液比3∶100(g∶mL)、初始接种量1.5×108CFU/mL，对蛋白回收率而言，最佳发酵条件为A3B1C3，即发酵时间3 d、料液比1∶100(g∶mL)、初始接种量1.5×108CFU/mL。对两种工艺进行验证实验，结果如表3和表4所示，多肽得率两种工艺无显著差异，水解度A3B2C3更高，可达(13.50±0.19)%，蛋白回收率A3B1C3更高，可达(14.39±0.48)%。

2.3 南极磷虾粗多肽的体外抗氧化活性分析

2.3.1 自由基清除率

氧化反应会产生损害细胞的自由基，主要包括活性氮(reactive nitrogen species，RNS)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)两种[20]。因此，自由基清除实验是筛选具有高抗氧化活性蛋白质水解物的一种有效、简便的方法。

DPPH自由基为活性氮自由基，其清除率广泛用于天然提取物抗氧化活性的评估中。如图5-A所示，两种南极磷虾粗多肽对DPPH自由基的清除效果随样品质量浓度的增加先升高，后逐渐平稳。A3B1C3组粗多肽对DPPH自由基的半数效应浓度值(half clearance concentration，EC50)为1.55 mg/mL，A3B2C3组粗多肽对DPPH自由基的EC50值为2.24 mg/mL，对比PARK等[21]的研究结果，2种南极磷虾粗多肽对DPPH自由基的清除能力优于多数南极磷虾酶解产物对DPPH自由基的清除能力，且两者中前者的清除能力更强，这可能是因为各种肽段间存在相互促进的作用，且粗多肽中可能含有少量壳聚糖，也会提高粗多肽对DPPH 自由基的清除能力，但与维生素C对照组对DPPH自由基的清除能力仍存在差异。

表2 枯草芽胞杆菌发酵制备南极磷虾肽正交试验设计及结果Table 2 Design and results of orthogonal test in preparation of Bacillus subtilis

表3 枯草芽胞杆菌发酵制备南极磷虾肽正交试验结果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test results of Bacillus subtilis

表4 最佳发酵条件实验结果Table 4 Experimental results of optimal fermentation conditions

ABTS阳离子自由基清除率主要用于评价亲水性和亲脂性化合物的抗氧化活性[22]。如图5-B所示，2种南极磷虾粗多肽对ABTS阳离子自由基的清除效果与样品质量浓度的关系与DPPH自由基清除效果趋势一致，其对ABTS阳离子自由基的EC50值均为0.16 mg/mL，高于对DPPH自由基的EC50值，说明2种南极磷虾粗多肽对ABTS阳离子自由基的清除能力更强，这与LATORRES等[23]的研究一致，且当质量浓度为0.5 mg/mL时与维生素C对照组对ABTS阳离子自由基的清除效果接近。

羟自由基为活性氧自由基，是最具活性的自由基，可与生物体内的大多数生物分子发生反应，因此羟自由基清除能力在抗氧化活性评估中至关重要。如图5-C所示，两种南极磷虾粗多肽的羟自由基清除效果与样品质量浓度呈正相关。A3B1C3组粗多肽对羟自由基的EC50值为3.95 mg/mL，A3B2C3组粗多肽对羟自由基的EC50值为4.05 mg/mL，说明前者的羟自由基清除能力强于后者，推测前者中含有更多由极性氨基酸组成的肽段[24]，但与维生素C对照组对羟自由基的清除能力相比，仍处于较低水平。

A-DPPH自由基清除率；B-ABTS阳离子自由基清除率；C-羟自由基清除率图5 不同南极磷虾粗多肽的抗氧化分析Fig.5 Antioxidant analysis of different Antarctic krill crude peptides注：A～D不同字母表示同一南极磷虾粗多肽在不同质量浓度下自由基清除率差异显著(P<0.05)；a～c不同字母表示在相同质量浓度下各南极磷虾粗多肽间自由基清除率差异显著(P<0.05)(图6、图7同)

2.3.2 亚铁离子螯合力

机体内多数氧化反应都需要过渡金属离子的催化，因此亚铁离子螯合力广泛用于评价多肽的抗氧化能力[25]。结果表明，两种南极磷虾粗多肽的亚铁离子螯合力均与样品质量浓度具有量效关系。A3B1C3组粗多肽对亚铁离子螯合力的EC50值为0.22 mg/mL，A3B2C3组粗多肽的EC50值为0.23 mg/mL，二者无显著差异，但均处于较高水平，说明南极磷虾粗多肽中可能含有较多由中性和酸性氨基酸组成的肽段，其侧链中的羟基和氨基易于与亚铁离子结合，从而达到抑制氧化的作用[25]，但仍低于维生素C对照组的亚铁离子螯合力。

图6 不同南极磷虾粗多肽的亚铁离子螯合力Fig.6 Fe2+ chelating activity of different Antarctic krill crude polypeptides

2.3.3 总抗氧化能力

FRAP法是测定产物总抗氧化能力的常用方法，本实验以Trolox为参考抗氧化剂化合物，南极磷虾粗多肽的总抗氧化能力以Trolox等效抗氧化能力表示。如图7所示，随南极磷虾粗多肽质量浓度的升高，其总抗氧化能力呈增高趋势，且A3B1C3组的总抗氧化能力高于A3B2C3组，说明前者的组分中含有很好的氢或电子供应体，具有更强的还原力[25]，但仍低于维生素C的总抗氧化能力。

A-不同粗多肽总抗氧化能力；B-维生素C的总抗氧化能力图7 不同南极磷虾粗多肽的总抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of different Antarctic krill crude peptides

3 结论

本研究以南极磷虾粉为原料，脱脂后利用枯草芽胞杆菌发酵制备南极磷虾蛋白肽，得到2种最佳发酵工艺，通过体外抗氧化活性实验，两种南极磷虾粗多肽均具有良好的抗氧化活性，其中高水解度组粗多肽的总抗氧化能力更强，高蛋白回收率组粗多肽的DPPH自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率更强，但2组粗多肽的亚铁离子螯合力则无显著差别。本研究初步证实通过微生物发酵制备具有抗氧化性的南极磷虾蛋白肽具有可行性，但并未对此多肽进行分离纯化，多肽组成及抗氧化机制尚不明确，后续可针对单一肽段进行深入研究，以优选出抗氧化活性突出的特定肽段，为南极磷虾粉的全效利用和生物加工提供参考。