超微粉碎对米糠多酚的组成及抗氧化活性的影响

卫子颜，谢勇，王朦朦，蔡梦思，唐兰兰，刘雄

(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)

据统计，稻谷是我国的第二大粮食作物，其中2019年产量为1.078 7亿t[1]。米糠是稻米加工的副产物，是米粒(胚乳)的表皮、胚和一些淀粉质胚乳的混合物，约占稻谷重量的10%，含有丰富的不饱和脂肪酸、膳食纤维、矿物质及多酚等营养成分[2]。研究表明，米糠中的多酚含量达4.13 mg GAE/g[3]，多酚种类主要包括阿魏酸、对香豆酸、香草醛、咖啡酸、香豆酸等，具有较好的抗氧化活性；此外，这些酚类物质能通过调节肠道菌群的构成及肠道酶的活性有效改善胃肠健康[4]、通过抑制NF-κB等信号通路来减轻炎症保护心肌细胞[5]、预防结肠癌等疾病[6]。然而，由于米糠的口感较粗糙且不易消化，大部分被用作饲料或直接被丢弃，造成了米糠资源的浪费。

超微粉碎是一种高效、绿色的食品加工技术，通过机械或流体动力学的方法将原料加工为微米级甚至是纳米级，减小原料的粒径，不仅可以改善原料的理化、功能、食用特性，还可促进原料中营养物质、生物活性组分的释放和吸收[7-8]。CHAIT等[9]、蔡婷等[10]发现超微粉碎处理能显著提高角豆、苦荞中多酚类物质的含量及抗氧化能力。目前，超微粉碎技术应用于米糠的研究大部分体现在理化及功能性质方面[11-12]，而对米糠中多酚的组成及功能活性影响的关注甚少。例如，WANG等[13]研究了米糠中结合酚类化合物的组成及抗氧化活性，发现结合酚中的酚酸主要有阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸等，张媛等[14]探究了超微粉碎对脱脂小米米糠抗氧化性的影响，发现微粉粒径的大小与其抗氧化能力呈负相关性，但对超微粉碎处理对米糠中多酚组成和抗氧化活性之间的相关性未进行深入的探讨。另外，鲜有人关注加工对米糠多酚在消化道的释放的影响。

因此，本研究将米糠进行超微粉碎处理，探究超微粉碎对米糠中酚类化合物的含量及组成、DPPH自由基清除力、ABTS阳离子自由基清除力、铁离子还原能力(ferric reducing antioxidant power，FRAP)以及体外胃肠释放度的影响，并分析米糠多酚的含量、组成与抗氧化能力之间的相关性，以期建立超微粉碎对米糠多酚类成分的影响规律，为米糠的深加工研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米糠，湖北省恩施市新塘乡；标准品没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、对香豆酸、香草醛、香草酸、阿魏酸、槲皮素，北京迈瑞达科技有限公司；水溶性维生素E标准品、ABTS、DPPH、福林酚试剂，北京索莱宝科技有限公司；胃蛋白酶、胰酶、胆盐，美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

BJ-300型高速多功能粉碎机，上海拜杰实业有限公司；CJM-SY-B高能纳米冲击磨，秦皇岛市太极环纳米制品有限公司；BIOTEK型酶标仪，美国基因公司；AXTG16G离心机，盐城市安信实验仪器有限公司；SHZ-88型水浴振荡器，朗越仪器制造公司；LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；Mastersizer 3000激光粒度仪，英国马尔文公司。

1.3 实验方法

1.3.1 超微脱脂米糠粉的制备

将新鲜米糠用乙醇进行脱脂处理，烘干后过60目筛，得到粗粉；使用BJ-300型粉碎机粉碎粗粉2 min，得到微粉A；使用高能纳米冲击磨粉碎粗粉，得微粉B。用Mastersizer 3000激光粒度仪测得粗粉、微粉A、微粉B的平均粒径分别为208.3、85.7、14.9 μm，装袋密封，于-18 ℃冰箱保藏备用。

1.3.2 米糠游离态酚、结合态酚的提取

米糠游离酚、结合酚的提取参考文献[15]的方法并稍做修改，称取1.5 g米糠与50 mL预冷丙酮溶液(80%，体积分数)混合，超声提取30 min后，以8 000×g离心10 min，重复3次，合并上清液并在45 ℃下旋转蒸干，用甲醇定容至10 mL，-18 ℃保存。将提取完游离酚后的残渣在室温下加入2 mol/L的NaOH溶液40 mL，充入N2，避光振荡1 h，用6 mol/L的HCl溶液将pH调至2.0，加入40 mL乙酸乙酯，混匀，重复5次，合并上清液在45 ℃下旋蒸，用甲醇定容至10 mL，即得结合态多酚，-18 ℃保存。

1.3.3 总酚含量的测定

参考SINGLETON等[16]的方法，并略做修改。用Folin-Ciocalteu法进行测定，以没食子酸作为标准品制作标准曲线。

1.3.4 HPLC法检测米糠中的酚类物质

取样品溶液过0.22 μm滤膜，用日本岛津LC-20A HPLC仪检测多酚组成。色谱条件：色谱柱为Thermo-C18(150 mm×4.6 mm，3 μm)、流动相流速为0.7 mL/min、柱温30 ℃、进样量10 μL、检测波长为280；流动相A相：0.4%乙酸水溶液，B相：乙腈。梯度洗脱程序：5%B (0 min)，25%B (0～40 min)，35%B (40～45 min)，50%B (45～50 min)，5%B (50～55 min)。以没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、对香豆酸、香草醛、香草酸、阿魏酸、槲皮素为标准品，混标进样，绘制标准曲线得各标准品的线性方程，计算提取液中的主要酚类物质含量。图1为9种混合多酚标准品的HPLC图，表1为各标准品峰面积与质量浓度之间的回归方程。

1-没食子酸；2-原儿茶酸；3-对羟基苯甲酸；4-香草酸；5-咖啡酸；6-香草醛；7-对香豆酸；8-阿魏酸；9-槲皮素图1 多酚混合标准品的HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of standard mixture

表1 九种标准品的回归方程Table 1 Regression equations of nine standard substances

1.3.5 体外抗氧化活性测定

1.3.5.1 DPPH自由基清除力测定

参考ROY等[17]的方法，将样品稀释20倍，向1 mL待测样品中加入48 mg/L的DPPH溶液2 mL，混匀，在室温下避光反应30 min，测定517 nm处的吸光度。以Trolox为参照，结果以每100 g多酚提取物(以干基计)所对应的Trolox当量表示(μmol Trolox/100g)。

1.3.5.2 ABTS阳离子自由基清除力测定

参考徐洪宇等[18]的方法测定。取0.1 mL待测溶液与2.9 mL ABTS阳离子自由基稀释液混合，于黑暗处30 ℃反应10 min，并在734 nm下测定其吸光度。以去离子水作空白，结果以每100 g多酚提取物(以干基计)所对应的Trolox当量表示(μmol Trolox/100g)。

1.3.5.3 FRAP测定

根据中国南京生物工程研究所提供的试剂盒的要求进行测定。酚类样品将Fe3+还原为Fe2+，在测定过程中，Fe2+与菲咯啉类物质反应生成络合物。记录520 nm处的吸光度，结果以每克多酚提取物(以干基计)所还原的Fe2+当量表示(μmol Fe2+/g)。

1.3.6 体外模拟胃、肠消化

参考SUN等[19]的方法称取0.5 g米糠粉，加入50 mL胃液，混匀后，在37 ℃水浴中水平振荡(150 r/min)消化1 h，然后将所得的消化物以4 000 r/min离心10 min，取5 mL上清液作为胃消化液，-20 ℃贮存。剩余消化液用10% NaOH溶液调至pH为7.0，然后加入5 mL肠液，混匀，在37 ℃水浴中水平振荡(150 r/min)消化4 h，然后将所得的消化物以4 000 r/min离心10 min，取5 mL上清液作为肠消化液，-20 ℃贮存。

1.3.7 多酚化合物的体外释放度

参考YOU等[20]的方法计算酚的体外释放度，模拟体外胃肠消化后酚的释放度按公式(1)计算。

(1)

式中：A是在体外消化后样品中的总酚含量，mg；B是体外消化前样品中的总酚含量，mg。

1.4 数据处理与分析

本研究中每个试验均重复进行3次，采用Microsoft Excel 2019 统计数据、SPSS 25.0分析显著性、Origin 2018软件作图，实验结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 超微粉碎对米糠多酚含量的影响

超微粉碎后米糠的多酚含量变化如表2所示，2种微粉的游离酚、总酚含量均显著高于粗粉(P<0.05)，而结合酚含量则低于粗粉组。与粗粉相比，微粉A、B的总酚含量分别增加了2.30%、5.21%。超微粉碎处理显著提高了米糠多酚等营养物质的溶出，这与赵萌萌等[21]报道超微粉碎后青稞麸皮中多酚含量增加的结果一致。一方面是由于超微粉碎处理使米糠的细胞壁结构被破坏，米糠粉体的蛋白质、膳食纤维网络结构发生变化、细化，细胞内部的成分溶出的阻力减小，从而使米糠中酚类物质的溶出率提高；另一方面，超微粉碎处理增大了米糠粉体的孔隙率以及与提取溶剂的接触面积，使提取更充分，从而增加了微粉多酚提取物的含量。而超微粉碎处理后结合酚的含量均有所降低，这与TAO等[22]发现超微粉碎柑橘皮渣中结合酚含量下降18.0%的结果类似。这可能是机械化作用及粉碎过程中的热效应可使多酚与细胞壁物质之间的共价作用或非共价作用解除，结合酚与细胞壁结构成分如纤维素、木质素等之间的酯键、糖苷键部分断裂，而导致结合态多酚向游离态多酚转化[23]。

表2 超微粉碎处理的米糠中多酚含量 单位:mg GAE/g

2.2 超微粉碎处理对米糠多酚组成的影响

超微粉碎后米糠中酚类物质(游离型、结合型)的主要成分与含量如表3所示。

表3 超微粉碎处理的米糠中多酚的组成及含量 单位:μg/g

超微粉碎处理对米糠中酚类物质的组成及含量均有一定影响，且粗粉、微粉A、微粉B的总酚类物质含量差异显著(P<0.05),分别为1 466.97、1 620.44、1 666.11 μg/g。米糠中提取出的酚类物质主要有原儿茶酸、香草酸、对香豆酸、香草醛、阿魏酸，其中游离酚以香草酸、香草醛、对香豆酸、阿魏酸为主，结合酚以香草醛、对香豆酸、阿魏酸为主。阿魏酸含量最多，达1 234.53 μg/g，是米糠结合酚中最主要的酚酸，只有少量的对羟基苯甲酸、咖啡酸。不同粉碎方式对米糠提取物中多酚组分有一定影响，超微粉碎处理后游离酚中原儿茶酸、香草醛、阿魏酸含量明显增加，结合酚中对香豆酸、阿魏酸含量明显增加。由于本实验选用的标准品种类以及检测条件有限，米糠多酚提取物中还存在未检出的单体酚类化合物。如WANYO等[24]从米糠多酚提取物中除检出原儿茶酸、对香豆酸、阿魏酸，还检测出丁香酸和芥子酸。ZHANG等[25]在米糠多酚提取物中还检出山萘酚、异阿魏酸。

2.3 超微粉碎处理对米糠多酚抗氧化活性的影响

如图2所示，米糠粗粉及2种微粉的多酚提取物均有一定的抗氧化活性，且微粉组的抗氧化活性显著高于粗粉(P<0.05)。米糠粉体的DPPH自由基清除力(图2-a)、ABTS阳离子自由基清除力(图2-b)、FRAP(图2-c)均随粉碎粒度的减小而逐渐增大，其中微粉B的多酚提取物具有最高的抗氧化能力。相较于粗粉，微粉B多酚的DPPH自由基清除力、ABTS阳离子自由基清除力、FRAP分别增加了33.21%、22.88%、30.11%。一方面可能是因为米糠微粉的粒径越小，组织被破碎的程度越彻底，多酚等抗氧化物质与提取溶剂的接触面积增大，更易于溶出，使粉体的抗氧化活性提高；另一方面可能是超微粉碎处理后米糠粉体中的多酚组成发生了变化，微粉中抗氧化性较强的酚酸，如对香豆酸、阿魏酸等含量增加[26]，从而增强了粉体的抗氧化能力。

a-DPPH自由基清除力；b-ABTS阳离子自由基清除力；c-FRAP还原能力图2 超微粉碎处理对米糠多酚抗氧化活性的影响Fig.2 Effect of ultrafine grinding treatment on the antioxidant activity of rice bran polyphenols注：字母a、b、c表示差异显著(P<0.05)

2.4 米糠酚类物质含量与抗氧化活性之间的相关性分析

为进一步明确米糠中的酚类物质含量与其抗氧化活性的关系，进行相关性分析。由表4可知，米糠中的总酚含量与DPPH、ABTS、FRAP法测定的抗氧化活性均呈显著正相关(P<0.05)，其相关系数分别为0.989、0.997、0.986。米糠中多酚含量越高，其清除自由基的能力越强，说明米糠酚类提取物中含有丰富的抗氧化物质。对香豆酸、阿魏酸、香草醛与米糠多酚提取物的DPPH自由基清除力、ABTS阳离子自由基清除力、FRAP成显著正相关(P<0.05)，说明对香豆酸、阿魏酸、香草醛是米糠多酚提取物中抗氧化的主要贡献物质，这与ZHAO等[27]报道的米糠多酚中对香豆酸、阿魏酸是清除自由基能力的主要贡献物质的结果一致，可能是由于对香豆酸、阿魏酸在米糠多酚中有较高的含量。

2.5 体外模拟胃肠消化过程中米糠总酚的含量及释放度

酚类要在人体内发挥健康益处，前提是它们可以通过胃肠道被吸收和代谢，最终在特定组织或器官上起作用，发挥其健康益处。在消化过程中，大多数游离酚的释放主要发生在上消化道，而结合酚主要通过肠道酶和微生物酶的作用在较低的消化道中，破坏结合酚与细胞壁之间的共价键来释放结合酚[28]。由表5可知，米糠中的总酚含量在经过体外模拟胃肠道消化后，呈现出先降低后升高的趋势，这与朱秀灵等[29]关于苹果中的酚类化合物体外消化的研究结果相似，说明胃肠消化会使酚类化合物发生降解或者转换，从食物基质中释放出来。且肠道消化期间酚类化合物的释放量增加，可能是由于肠酶和胆汁盐的作用，使与基质结合的酚类化合物得到释放。酚类物质的体外消化释放度随米糠粒径的减小而逐渐增加，与粗粉相比，微粉A、B的体外释放度分别提高了2.61%、7.31%。这可能是因为超微粉碎后的米糠粒径越小，比表面积越大，从而增强了细胞壁中的多酚与胃肠消化液之间的相互作用，促进多酚的释放。此外，超微粉碎会使糊粉细胞破裂，改变了食物基质中酚类物质的结构特性，及其与蛋白质、多糖等成分的相互作用，使多酚更具有生物可及性[30]。

表4 米糠中酚类物质含量与体外抗氧化活性的相关性分析Table 4 Correlation analysis of phenolic substances in rice bran and antioxidant activity in vitro

表5 体外胃肠消化后米糠中酚类化合物的释放度 单位：mg GAE/g样品

3 结论

(1)米糠经超微粉碎处理后，其多酚提取物含量均显著增大(P<0.05)。与粗粉相比，微粉A、B的多酚提取物含量分别增加了2.30%、5.21%，微粉B(粒径为14.9 μm)的多酚提取物含量最高，为(5.113±0.012) mg GAE/g。米糠中的酚类物质主要有原儿茶酸、香草酸、香草醛、对香豆酸、阿魏酸，其中游离酚以香草酸、香草醛、对香豆酸、阿魏酸为主，结合酚以香草醛、对香豆酸、阿魏酸为主。超微粉碎处理后游离酚中原儿茶酸、香草醛、阿魏酸含量明显增加，结合酚中对香豆酸、阿魏酸含量明显增加。

(2)2种微粉(粒径分别为85.7、14.9 μm)的抗氧化活性(DPPH自由基清除力、ABTS阳离子自由基清除力、FRAP)均显著优于粗粉(粒径为208.3 μm)(P<0.05)，且米糠粉体的粒径越小，其抗氧化活性越强。

(3)米糠中的多酚含量与DPPH、ABTS、FRAP法测定的抗氧化活性均呈显著正相关(P<0.05)。米糠酚类提取物中香草醛、对香豆酸、阿魏酸是清除DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、还原Fe3+的主要贡献物质。微粉A、B的体外释放度分别提高了2.61%、7.31%。

以上表明，超微粉碎技术既减小了米糠粉体的粒径，一定程度上提高了酚类物质的溶出率、体外抗氧化活性、体外释放度。然而，本研究中体外消化实验不包括结肠发酵阶段，需要通过结肠发酵模型来完整地模拟米糠中多酚化合物在体内的吸收和代谢，才能更好地评价其生物体外释放及生物利用情况，为探究米糠的功能特性提供科学依据。