奶豆腐制作过程中细菌多样性与风味物质研究

达林，苏馨,2，刘文俊,2，孟和毕力格*

1(内蒙古农业大学,乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特，010018)2(农业农村部奶制品加工重点实验室，内蒙古 呼和浩特，010018)

奶豆腐是原料生鲜乳经蒙古族传统工艺制成的奶酪类制品。产自内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗的奶豆腐被批准为国家地理标志产品，因其拥有独特的风味和质构而备受区内外消费者的青睐。通常奶豆腐的制作工艺是先将未经热处理的鲜牛乳自然发酵酸化凝乳，之后对发酵乳进行脱脂处理即分离去除其奶油层，再对发酵乳进行热处理使乳清析出去除，再继续加热并不停地搅揉使乳蛋白变性，乳蛋白黏性增加且呈拉丝状时立即装入模具，冷却成型后脱离模具并放置阴凉处干燥、成熟，即可食用。蒙古族传统奶豆腐制作工艺的关键点在于前期鲜牛乳的发酵和后期工艺中的热处理成型、成熟等操作，源自原料鲜牛乳及制作环境中的乳酸菌参与构建奶豆腐的菌群并对奶豆腐独特风味特征的贡献较大[1]。

蒙古族传统工艺制成的奶豆腐在工艺上与我国新疆哈萨克族和国外中东中亚地区加盐制作的工艺有明显的差异[2]。不同地区传统奶豆腐因其制作环境及贮藏条件等因素的差异，其细菌菌群也有显著差异。任冬艳等[3]对蒙古国部分奶酪经细菌多样性分析发现了76个菌种，其中丰度较高的菌种除了常见的乳酸菌外还有一些肠杆菌，这与意大利和俄罗斯布里亚特地区奶酪菌群的结构不同。洋洋等[4]从蒙古族奶豆腐中分离到的优势乳酸菌菌种主要以德氏乳杆菌和乳酸乳球菌为主，并用电子舌和电子鼻等测定其风味特征，认为奶豆腐样品间苦味差异较大。目前奶豆腐在我国消费市场远未饱和，主要原因与其生产规模化程度较低和产品品质参差不齐等因素有关，对传统工艺进行机械化、现代化、标准化才能够提升其市场竞争力和产品品质。本研究选择锡林浩特市具有典型特色的奶豆腐加工作坊，动态采集原料乳及其奶豆腐加工各阶段样品，对其进行乳酸菌菌株分离，同时分析其间细菌群落结构的变化规律以及挥发性风味物质，以期为奶豆腐加工技术的优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

在锡林浩特市选择两家奶食品加工作坊，其中一家为在锡林浩特市区内正蓝旗奶豆腐作坊(XS)，另一家为位于锡林浩特市周边宝力根苏木的奶食品厂(XB)。采样时，随奶豆腐制作工序采集了原料鲜牛乳、发酵乳、嚼克(牛乳发酵过程中浮于上表层的奶油)、热处理过程中的发酵乳、乳清和奶豆腐成品等样品用于试验分析，详见表1。

表1 奶豆腐等样品信息表Table 1 Information of hurood and other samples

1.2 试验方法

1.2.1 样品中乳酸菌分离鉴定与活菌计数

样品中乳酸菌分离和计数分别采用涂布法、倾注法。将12份样品用生理盐水进行梯度稀释，分别取10-5、10-6、10-7梯度稀释液各1 mL于无菌Φ90 mm培养皿中，倾注含有多粘菌素和放线菌酮的MRS琼脂培养基与样品稀释液混匀待凝固后倒置平板于厌氧工作站(气体条件为CO2∶H2∶N2=10%∶10%∶80%)中 30 ℃ 培养48 h。计数板按梯度计算即为1 mL样品的菌落数。从计数板和涂布板上挑选出革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的单菌落于MRS液体培养基中30 ℃培养48 h，划线纯化培后的菌株经扩培后离心收集菌体，加入含0.1%谷氨酸钠灭菌脱脂乳保护剂，分装于冻存管和无菌安瓿管中，液氮速冻后于-80 ℃冰箱中冻存备用[5]。

乳酸菌菌株基因组DNA的提取：采用TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离株基因组DNA[6]。采用微量紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行基因组DNA纯度和浓度的检测，若乳酸菌DNA的OD260/280值在1.8～2.0即为质量较好的DNA样品。将检测合格的DNA稀释至100 ng/μL 用于16S rRNA的扩增。所用16S rRNA基因序列通用引物为：正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)。PCR反应体系(50 μL)：正、反向引物(10 μmol/L)各1.5 μL，模板DNA(<100 ng)1.5 μL，KAPA Mix 25.0 μL，ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；98 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 2 min。PCR扩增完毕后，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后在凝胶成像仪上进行条带的观察，若在1 500 bp处条带清晰、明亮且无拖尾现象，则视为PCR 扩增产物符合测序要求。将扩增成功的PCR产物送样上海美吉生物医药科技有限公司进行双向测序。测序获得的序列文件利用DNA Star软件中SeqMan模块进行序列整理和拼接，利用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行分离株的16S rRNA 基因序列同源性比对，同源性>99%的则可视为同一菌种[7-8]。

1.2.2 细菌DNA的提取与16S rRNA基因片段的扩增

使用OMEGA EZNA®Soil 微生物宏基因组 DNA 提取试剂盒抽提样品中的宏基因组DNA，对提取后的DNA进行纯度、浓度的检测，满足条件后进行16S rRNA基因片段的PCR扩增[9]。

1.2.3 构建文库与上机测序及生物信息学分析

各样品的PCR产物经纯化后进行质量混合等操作后，用 Pacific Biosciences Template Prep Kit 2.0 构建DNA文库，使用Calculater v2.3.3 软件计算出引物和聚合酶的添加量，加入文库中，混匀后上机，使用PacBio RS Ⅱ 测序仪进行测序。使用SMRT®Portal(V2.7)中RS ReadsOfInsert.1对扩增成功的原始下机数据进行测序质控，保留符合以下标准的序列：(1)最小通过率设定为5；(2)最小预测精确度为90；(3)最短插入序列长度为1 400 bp；(4)最大序列长度为1 800 bp。采用 PyNAST 将质控结束的序列校准排齐，使用UCLUST algorithm在>97%的相似性条件下划分操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)。去除属于嵌合体OTU后，使用RDP(ribosomal database project，Release11.5)、Sliva(v128)及 Greengenes(v13.8)数据库确定各OTU的分类学地位，进而计算各样品细菌在门、纲、目、科、属和种水平的相对含量。计算各组样本Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和发现的物种数量指数(Observed species)，用于评估α多样性。基于Unifrac距离对样品之间进行加权(weighted)和非加权(unweighted)的主坐标分析(principal coordinate analysis，PCoA)[10-11]。

1.2.4 奶豆腐制作过程样品中挥发性风味物质测定

通过SPME-GC-MS技术对奶豆腐加工过程中不同阶段的挥发性风味物质进行测定。将3.0 g待测奶豆腐样品装入15 mL无菌萃取瓶中，置于50 ℃水浴中平衡30 min，然后将老化好的纤维萃取头插入萃取瓶中进行萃取。萃取结束后取出萃取头，插入GC汽化室中进行GC-MS分析，为保证实验结果的稳定性，每个萃取条件重复实验3次。GC条件：采用HP-5毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为He，流速为1 mL/min。色谱柱升温程序为：起始柱温35 ℃，保持3 min，以5 min温程升到100 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升到150 ℃，最后以8 ℃/min温程升到230 ℃，保持3 min。不分流进样。MS条件：电离方式为EI源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描模式全扫描，质量扫描范围m/z20～350[12]。

2 结果与分析

2.1 样品中乳酸菌的分离培养与活菌计数

奶豆腐制作过程中不同采样时间点的12份样品共计分离得到166株乳酸菌，如表2所示，包括嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、乳明串珠菌(Leuconostoclactis)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。如图1所示，在传统奶豆腐的制作过程中，乳酸菌菌落总数整体保持在4～9 lgCFU/mL。在发酵乳和嚼克中乳酸菌活菌数达到最高(8～9 lgCFU/mL)；在加热发酵乳和成品奶豆腐中活菌数降至最低(4～5 lgCFU/mL)；原料鲜牛乳和乳清之间的活菌数集中在(6～8 lgCFU/mL)。

表2 奶豆腐加工过程中不同时间点样品分离乳酸菌菌株数统计Table 2 Lactic acid bacteria isolated from hurood samples at different processing point

图1 奶豆腐加工过程中不同时间点样品的乳酸菌活菌数Fig.1 Viable count of lactic acid bacteria in hurood at different processing point

2.2 奶豆腐制作过程样品中细菌多样性分析

所有样品中的细菌在门水平上主要隶属于厚壁菌门(Firmicutes，93.6%)、变形菌门(Proteobacteria，4.7%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，1.2%)；在属水平上共检测到109个菌属，其中平均相对含量>1%的菌属为乳球菌属(Lactococcus，74.5%)和链球菌属(Streptococcus，17.4%)；在种水平上共检测到237个细菌种，其中每类样品平均相对含量>1%细菌菌种有9个分别为：乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、鱼乳球菌(Lactococcuspiscium)、棉籽糖乳球菌(Lactococcusraffinolactis)、马其顿链球菌(Streptococcusmacedonicus)、唾液链球菌(Streptococcussalivarius)、解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica)、约氏不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)。六类样品中细菌在种水平的组成如图2所示。

图2 奶豆腐加工过程中基于种水平上不同时间点的细菌菌群相对含量Fig.2 Relative abundance of bacterial flora at species level in hurood at different processing point

该研究通过α多样性分析奶豆腐制作过程中各样品种细菌群落多样性、丰度和均匀性，各样品细菌α多样性指数如表3所示，在此过程中菌群多样性的变化在两组样品中一致：原料鲜牛乳经自然发酵后α多样性指数全部降低，发酵乳经加热排净乳清后α多样性指数全部升高，冷却成型后α多样性指数又全部降低。

表3 奶豆腐加工过程中不同时间点样品α多样性的比较Table 3 α diversity comparison of hurood at different processing point

该研究通过β多样性对奶豆腐制作过程不同阶段样品的微生物菌群多样性进行比较，基于Weighted UniFrac距离进行细菌群落PCoA。细菌菌群结构如图3所示,发酵前(XB1、XS1)两组样品差异较大，发酵后(XB2、XS2)两组样品差异较小，加热处理时(XB3、XS3)两组样品差异较小，奶豆腐成品时(XB6、XS6)两组样品差异较小且与发酵时(XB2、XS2)菌群结构相似。将样品相对应的坐标点随奶豆腐制作工序依次连接后发现：在原料鲜牛乳经发酵、加热和成型的3个主要制作过程中，两组样品在空间上呈排布相似的趋势。

2.3 奶豆腐加工过程样品中挥发性风味物质测定

所有样品中共检测到62种挥发性风味化合物，如图4所示，奶豆腐加工过程中各类挥发性风味物质总量，其中包括酸类化合物10种，醛类化合物7种，醇类化合物9种，酮类化合物13种，酯类化合物9种，芳香族化合物及其衍生物7种，其他合物7种。酸类化合物主要有乙酸、丁酸和辛酸等；醛类化合物主要有乙醛、戊醛和壬醛等；醇类化合物主要有3-甲基-1-丁醇、3-甲基-3-壬醇和4-甲基-1-己醇等；酮类化合物主要有乙偶姻、2-庚酮和5-羟基-2,7-二甲基-4-辛酮等；酯类化合物主要有乙酸乙烯酯、己酸乙酯和邻苯二甲酸环丁基十三酯等；芳香族化合物及其衍生物有甲苯、苯乙醇和苯乙醛等；其他化合物主要为胺类化合物，如二甲胺、甲酰胺和甲氧基苯基肟。

图3 基于非加权的UniFrac奶豆腐加工过程中不同时间点样品菌群结构的主坐标分析Fig.3 Principal coordinate analysis on unweighted of bacterial flora of hurood at different processing point

图4 奶豆腐加工过程中各类挥发性风味物质总量Fig.4 The total amount of various volatile flavor compounds of hurood at different processing stage

为探究菌群对样品产生挥发性风味物质的影响，对它们之间的共变化趋势进行分析，经Procrustes转换和显著性检验发现两者之间相关性显著(P<0.05)，对筛选得到的菌群与挥发性风味物质之间进一步分析，如图5所示。L.lactis与乙酸显著正相关(P<0.01)，与异丙胺显著负相关(P<0.01)，与丙酮和2-乙基己醇显著负相关(P<0.05)；S.thermophilus与甲酰胺、2-甲基-4,6-辛二炔-3-酮、2,3-丁二醇、2-庚酮显著负相关(P<0.05)；L.piscium与2,3-戊二酮显著正相关(P<0.001)，与戊酸乙酯和1-辛硫醇显著正相关(P<0.01)；R.ornithinolytica与乙酸显著正相关(P<0.01)；L.raffinolactis与戊酸显著正相关(P<0.01)；A.johnsonii与4-甲基-1-己醇显著负相关(P<0.01)；E.faecalis与苯乙醇显著正相关(P<0.01)；S.salivarius与2,3-丁二醇显著负相关(P<0.01)。

图5 奶豆腐加工过程优势菌种和挥发性风味物质的相关性分析Fig.5 Correlation analysis between dominant strains and volatile flavor compounds of hurood

3 讨论

该文通过纯培养分离鉴定方法和PacBio SMAT测序技术，探究了奶豆腐从原料乳至成品整个制作过程中细菌菌群多样性，研究了风味物质的组分和含量的变化情况，并分析了菌群结构与挥发性风味物质之间的相关性。奶豆腐制作过程中微生物群落的生长与代谢均会随发酵过程中温度、pH及环境条件等改变而相应变化。乳酸菌在生鲜乳发酵期间迅速生长而使pH降低[13]，在发酵乳和嚼克时活菌数达到峰值为8～9 lgCFU/mL：随后呈现下降趋势直至4～5 lgCFU/mL，这是由于发酵完成后很多微生物因加热导致生长受到抑制甚至死亡[14]。在整个过程中所有样品，通过分离培养得到最多的菌种为L.lactis和S.thermophilus，与通过PacBio SMAT测序技术得到的结果一致，该两种乳酸菌为样品中的优势细菌。在种水平上，原料鲜牛乳中的菌种丰富度明显大于发酵乳，其中L.raffinolactis、L.piscium和A.johnsonii的相对含量在原料鲜牛乳中最高，L.piscium在XB1中的相对含量高达50.4%，但并没有通过分离培养得到，是因为该菌为嗜冷乳酸菌[15]，而该研究中培养温度为30 ℃；A.johnsonii为条件致病菌，可引起人与动物感染发病广泛分布于水、土壤等环境中[16-17]，说明原料乳与外界接触造成了一定程度的污染，原料乳经室温自然发酵之后由于L.lactis和S.thermophilus数量的增多导致这3种细菌的生长受到抑制甚至消亡，由于相对含量的变化菌种丰富度便明显降低。原料鲜牛乳发酵后相对含量最高的菌种为L.lactis，该菌种也是后续工艺中含量最多的菌种。E.faecalis广泛分布于环境中[18]，其在发酵过程中相对含量最高，随着后续工序的进行仅检测到痕量。发酵乳经40 ℃左右进行加热排净乳清时，S.thermophilus相对含量明显升高，而其他菌相对含量均降低，在成品奶豆腐中S.thermophilus相对含量明显降低，L.lactis在此时又成为相对含量最高的细菌。来源自人体S.salivarius[19]在产品奶豆腐时消失，而之前的制作过程中均不同程度地被检测到。S.salivarius、R.ornithinolytica、A.johnsonii和E.faecalis等细菌在奶豆腐制作过程中不同程度地被检测到，可能是由于在整个过程中通过挤奶、外界环境、器具或者人员接触污染所致，但是随着发酵时间的延长和pH的降低，数量快速减少甚至消失。

原料鲜牛乳经发酵、加热、定型时，XB和XS两组样品的α多样性指数的升降与β多样性的变化都分别体现一致的规律。两组奶豆腐制作过程的样品中：α多样性指数总体呈现先降低、后升高、再降低的趋势。原料乳发酵后可能由于L.lactis大量生长且在菌群中占比较高导致4个α多样性指数均降低；发酵乳加热时可能由于与环境中加热器具的接触从而改变微生物丰度导致4个α多样性指数均升高；后续过程可能由于S.thermophilus等细菌的减少从而改变微生物丰度导致4个α多样性指数均降低。通过β多样性分析即细菌群落主坐标分析，可观察到在原料鲜牛乳发酵成自然发酵乳，再加热排净乳清最终至成品奶豆腐中，对应坐标点连接后在空间上呈排布相似的趋势。但在发酵和加热过程中分别产出的副产物即嚼克和乳清，这两类样品相对其主产物在α多样性指数的增减和β多样性中样品对应坐标点的空间变化均没有在XB和XS两组样品中呈现一致的规律，这可能是由于这两种副产物在剔除出工艺流程后是与不同环境下的人员或机器进行接触，导致菌群结构变化无明显规律[20]。不同工艺流程点的样品中检测到了酸、醛、醇、酮、酯等挥发性风味物质，将检测到的化合物与菌种基于Procrustes分析对它们之间的共变化趋势进行分析，结果表明两者在空间排布上呈现一定的相似性，且相关性显著(P<0.05)。发酵乳制品中重点关注的化合物为羰基类化合物，其中主要为乙醛、丙酮、乙偶姻，还有脂肪酸类化合物包括乙酸、甲酸和丁酸等[21-22]。该研究发现乙醛和乙偶姻与L.piscium显著正相关(P<0.05)，丙酮与L.lactis和R.ornithinolytica显著负相关(P<0.05)，乙酸与L.lactis和R.ornithinolytica显著正相关(P<0.01)。

4 结论

该文基于Pacbio SMAT测序技术和分离培养方法对奶豆腐从原料至成品的菌群多样性进行了分析，获得了乳酸菌菌种资源，并对不同制作阶段风味物质含量和组分进行了研究。结果发现奶豆腐在制作过程中其菌群的演替存在特定规律，即各阶段α多样性指数均表现为先降低后升高再降低的趋势，表明鲜乳中复杂的微生物区系如L.raffinolactis、L.piscium和A.johnsonii等细菌随着发酵与热处理的进行其逐渐减少，而对产酸和风味起主要作用的乳酸菌成为优势菌，特别是L.lactis和S.thermophilus是奶豆腐制作后期和终产品的优势菌。各阶段样品中优势菌与风味物质存在显著的相关性(P<0.05)，其中L.lactis与酸类、酮类等重要挥发性呈味物质呈正相关关系。该研究通过对传统奶豆腐的制作过程中微生物多样性与风味物质的研究，为其工艺改良及风味优化奠定了一定的理论基础。