基于顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱技术的卤烤兔肉丁加工过程中挥发性风味物质变化分析

廖林，刘悦，贺稚非,2，李洪军,2*

1(西南大学 食品科学学院，四川 重庆，400715)2(重庆市特色食品工程技术研究中心，四川 重庆，400715)

兔肉具有较好的营养特性，有三高三低的优点，即高蛋白、高多不饱和酸、高消化率、低脂肪、低胆固醇、低能量。兔肉制品在近二十年来得到迅速发展，在世界范围内越来越受欢迎，尤其是在中国[1]。但目前国内外对兔肉精深加工程度却远低于其他畜禽肉，这极大地阻碍了我国兔产业的普及与发展。ABDEL-NAEEM等[2]通过研究不同加工方式对兔肉的理化性质和营养价值的影响，发现烘箱烘烤是对兔肉加工最好的烹饪方法，因为它既有益于健康，又满足消费者的需求。PEDRO等[3]以兔腿为原料，通过用KCl代替一定量的NaCl来研究如何提高干腌兔腿的营养，也为兔肉制品加工产业开辟新的道路。

酱卤肉制品是通过加入香辛料等辅料制成的熟肉制品，承载了源远流长的中国传统文化特色，其不仅保留畜禽肉本身的营养特性，还通过酱卤工艺赋予了肉制品浓香的滋气味和红亮的色泽，深受广大消费者的青睐。目前，关于酱卤肉制品的开发和研究大多集中于牛肉[4]、猪肉[5]等畜禽肉，而兔肉制品研究还相对缺乏。因此，开发出一种风味独特、营养健康的新型卤烤兔肉产品迫在眉睫。

本研究以自制的卤烤兔肉丁为研究材料，通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱(headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)技术，定性定量分析卤烤兔肉丁在加工过程中挥发性风味物质组分及含量，通过计算气味活性值(odor activity value, OAV)，确定不同加工阶段的主体风味物质和修饰风味物质，并运用主成分分析法对挥发性风味化合物的OAV值进行对比分析，确定不同加工过程中的主体风味物质，这对促进我国兔肉精深加工水平及规模化生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从重庆阿兴记良种选育基地挑选若干只70日龄的雄性伊拉兔子(2.5～2.8 kg/只)，按照国家畜禽屠宰加工卫生规范宰杀兔子，去除皮、头、内脏后立即放入装有冰袋的冷藏箱(6 ℃左右)运送到实验室。4 ℃ 排酸处理24 h后，将兔背最长肌切成大小相同的颗粒状(2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm)，分装到塑封袋内(500 g/袋)，于-18 ℃环境下贮藏，试验前12 h取出置于4 ℃气候箱解冻待用。

试验所需卤料(八角、香叶、香奈、花椒、桂皮)，重百超市；2-甲基-3-庚酮(色谱纯)，重庆跃翔化工有限公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010Plus型气相色谱-质谱联用仪，日本SHIMADZU公司；CAR/PDMS型75 μm萃取纤维头、57330-U型SPME手动进样手柄，美国Supelco公司；HH-4型数显恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司；FA114A型分析天平，上海豪晟科学仪器有限公司；DGG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；C21-KT2116E型多功能电磁炉，广东美的生活电器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

1.3.1.1 工艺流程

样品制备工艺流程如下：

原料兔肉处理→腌制→预煮→卤制→烤制→二次调味→包装→杀菌→成品

1.3.1.2 样品处理

取提前解冻完全的兔肉丁；采用湿腌法在4 ℃腌制24 h，每隔4 h翻动1次；将腌制后的兔丁进行预煮，保持沸水煮制20 min，并撇去浮沫；提前熬制好卤水，水沸后，保持功率为1 000 W卤制兔丁，60 min后捞出，放入烤盘；提前打开鼓风干燥箱，进行预热，设置烘烤温度为80 ℃。待温度达到80 ℃且稳定时，放入卤制好的兔丁，烤制40 min，每隔20 min翻动1次；将烤制后的兔丁放入锅中，向锅中加入芝麻、芝麻香油和花椒香油；待卤烤兔肉丁冷却至室温，进行真空包装；采用水浴巴氏杀菌(85 ℃，30 min)后得到成品。

1.3.2 气相色谱质谱检测条件

固相微萃取法条件参考DENG等[6]方法，略有修改。分别将新鲜兔肉、腌制、卤制、烤制、二次调味，成品6组样品用绞肉机绞碎，精确称取3.5 g(精确到0.001 g)肉样于20 mL顶空萃取瓶中，加入1 μL 0.816 mg/mL 2-甲基-3-庚酮，旋紧瓶盖并旋涡振荡使其混合均匀，在80 ℃条件下水浴平衡15 min，插入活化好的SPME萃取头，在80 ℃水浴条件下萃取30 min，萃取完成后立即插入GC进样口解析5 min。

气相条件参照CHE等[7]的方法，略有修改。GC分析毛细管柱为DB-5MS(30 m×0.2 mm, 0.25 μm)，压力为100.0 kPa；总流量为50.0 mL/min；柱流量为1.78 mL/min；进样口温度为250 ℃；载气为氦气，不分流进样。升温程序为：起始温度40 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min的速度升温至120 ℃，最后以10 ℃/min 的速度升温至230 ℃并保持5 min。

质谱条件参照CHE等[7]的方法，略有修改。电子电离源，电子能量为70 eV；接口温度为230 ℃；离子源温度为230 ℃；检测器电压为350 V；质量扫描范围为30～500m/z，溶剂延迟为1 min。

1.3.3 挥发性物质的定性与定量

根据化合物保留时间，将质谱数据与计算机中MS定性谱库(NISTO8.LIB与NISTO8S.LIB)进行检索并匹配，仅选取相似度大于80的化合物定性为该物质。参考李娟等[8]的方法，略有修改。定量分析采用以2-甲基-3-庚酮作为内标，依据峰面积比计算各挥发性风味物质的含量(假定各挥发性成分的绝对校正因子为1.0)，计算如公式(1)所示：

(1)

式中：Cx为未知挥发性化合物含量，μg/kg；C0为内标化合物质量浓度，μg/μL；V0为内标化合物进样体积，μL；Sx为未知挥发性化合物的峰面积；S0为添加的内标化合物峰面积；m为样品质量，kg。

1.3.4 挥发性风味物质评价

根据内标法算出卤烤兔中各挥发性风味物质的含量，查阅相应挥发性风味物质在水中的阈值。通常OAV值是评价挥发性风味物质对总体风味物质的贡献大小，计算如公式(2)所示：

(2)

式中：Ci为风味组分的浓度，μg/kg；Ti为相应风味组分的感官阈值，mg/kg。

当0.1≤OAV<1时，表明该挥发性风味物质只对总体风味物质起到辅导修饰的作用；当OAV≥1时，表明该风味组分对总体风味物质具有主体作用，对整体的风味起到较大的贡献[9]。

1.3.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 26软件对卤烤兔中产生的挥发性风味物质的气相色谱质谱数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 卤烤兔丁挥发性物质分析

由表1可知，在卤烤兔肉丁加工过程中共产生137种挥发性物质，其中鲜肉、腌制、卤制、烤制、二次调味和成品这6个加工过程中分别检出36、32、40、41、63和59种挥发性物质，含量依次为(675.28±0.09)、(332.11±0.38)、(582.08±0.27)、(457.51±0.41)、(986.47±0.45)、(722.27±0.11) μg/kg。鲜肉中的挥发性物质主要是醛类和酸类，分别占总质量浓度的38.29%和29.74%；腌制中的主要挥发性物质是醇类和醚类，分别占总质量浓度的78.48%和12.01%；卤制过程中的主要挥发性物质是醇类和酸类，分别占总质量浓度的53.66%和15.32%；烤制过程中的主要挥发性物质是醇类和酸类，分别占总质量浓度的58.29%和16.61%；二次调味过程中的主要挥发性物质是醇类和烃类，分别占总质量浓度的54.82%和24.02%；成品中的主要挥发性物质是醇类和烃类，分别占总质量浓度的46.55%和19.80%。

表1 卤烤兔肉丁中挥发性成分GC-MS分析结果Table 1 GC-MS analysis of volatile flavor components in bittern roast rabbit diced meat

续表1

续表1

2.2 醇类挥发性风味物质含量分析

通过OAV对卤烤兔肉丁加工过程中挥发性风味物质进行剖面分析，根据所得的OAV值确定风味物质的贡献大小。醇类物质是肉制品中重要的挥发性风味物质，主要是由脂肪氧化还原过程产生。卤烤兔肉丁的6个加工过程中存在大量的醇类物质，可能对卤烤兔肉丁的风味有影响的主要有芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、1-辛烯-3-醇、桉叶油醇、苯乙醇、辛醇、正戊醇和异龙脑等醇类，起主体作用的是芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇和桉叶油醇。其中2-丙烯-1-硫醇含量最大(阈值为0.000 1 mg/kg)，通常硫醇类化合物是构成合成香料中重要的化合物，并且具有一定的葱香和烤肉的香味，赋予肉制品较独特的风味[12]。芳樟醇具有铃兰香味[8]，在加工过程中含量相对较高，其主要出现在卤制、烤制、二次调味以及成品阶段，对卤兔肉丁的风味贡献较大。1-辛烯-3-醇是亚油酸氧化产物中的一种，具有蘑菇香味[13]，其阈值较低，虽然含量较少，但是其对卤烤兔肉丁的风味具有重要的修饰作用。在整个加工过程中醇类物质含量呈现先上升后下降的趋势，醇类物质的主要来源是脂肪酸的氧化降解[9]，随着加工过程的进行，脂肪酸氧化加剧，醇类物质逐渐增加，随着实验的进行，醇类会裂解为醛类或者酮类物质。

2.3 醛类挥发性风味物质含量分析

醛类物质是脂肪氧化的产物，对兔肉的风味物质产生较大的影响[14]。在加工过程中可能对卤烤兔肉丁风味有影响的主要有4-异丙基苯甲醛、苯甲醛、癸醛、壬醛、异戊醛和己醛等醛类，起主体作用的主要是壬醛、异戊醛和己醛。己醛是脂质氧化的主要标志物[14]和兔肉腥味的主要来源[15]，低浓度的醛类物质具有较好的肉味，较高的含量会产生不好的味道。在鲜肉阶段己醛含量为(252.80±0.01) μg/kg，腌制过后含量变为(1.94±0.02) μg/kg，可能是因为腌制过程中其他风味物质对其进行了掩埋或者消除；在烤制阶段中，己醛含量增加了，可能是加工过程中脂肪氧化转化为了己醛[15]。在二次调味和成品阶段产生了较多的醛类，其中壬醛和异戊醛含量最高，且其阈值较低，对卤烤兔肉丁的风味贡献比较大，壬醛主要是由油酸氧化产生，具有烤焦的香味[16]，壬醛主要在后面2个加工阶段产生，对风味有较大的贡献。在整个加工过程中，醛类物质含量呈现先下降后上升的趋势，醛类物质主要来源于脂肪的氧化分解，从腌制到成品阶段，醛类物质含量逐渐增加，对风味的贡献逐渐增大。

2.4 酯类挥发性风味物质含量分析

酯类主要也是脂肪氧化的产物，通常可以通过酸和醇的酯化反应形成[6]。由于酯类的阈值较大，OAV值都小于0.1，只对风味物质起到一定的修饰作用。在鲜肉阶段酯类含量较多，随后酯类含量急剧下降，随着之后的加工，酯类含量缓慢上升，主要原因是热加工过程中醇醛之间相互作用，产生了一定的酯类物质。

2.5 烃类挥发性风味物质含量分析

烃类物质一般阈值比较大，对挥发性风味物质贡献较少[17]。烃类物质在鲜肉阶段主要是茴香烯，在二次调味阶段和成品阶段主要含有(+)-柠檬烯、茴香烯、和萜品油烯等。由表1可以看出，经过长时间的加工，烃类物质种类与含量都增加了，说明长时间加工会导致烃类的含量增加[18]。但是由于阈值比较高，所以对风味物质的贡献比较小，其中茴香烯和叔丁基苯对卤烤兔肉丁的风味具有一定的修饰作用，只有(+)-柠檬烯对卤烤兔肉丁的风味起到主体作用。烃类物质主要来源于香辛调味料或脂肪酸的烷氧基裂解产生[8]，在进行二次调味时，烃类物质含量达到(236.93±0.18) μg/kg，随着加热的进行，在成品阶段含量有所下降。

2.6 酚类、酮类和醚类挥发性风味物质含量分析

酚类物质大部分来源于香料中，有研究者发现酚类物质是一些香料植物的主要成分[19]，在加工过程中会转移到产品中，从而增加产品的风味。在加工过程中草蒿脑的OAV值明显超过1，可以说草蒿脑对卤烤兔肉丁的风味起到重要的主体作用，草蒿脑是在卤制阶段后出现的，这也证实了草蒿脑主要来源于香辛料等物质中。随着加工的进行，草蒿脑的含量逐渐增加，是卤烤兔肉丁的主体风味之一。

酮类通常被认为是在脂质氧化、烷烃降解和仲醇脱氢过程中形成的副产物[6]，酮类化合物对肉味的形成有重大影响。酮类物质在性质上是稳定的并且具有持久的香气，通常带有花香。在6个加工过程只检测出了甲基庚烯酮，其OAV值小于1，只对卤烤兔肉丁的风味起到一定的修饰作用。在整个加工过程中，总酮类物质呈现先上升再下降的趋势，前期由于脂质氧化或美拉德反应而产生，后期作为后续反应的底物而被消耗[11]。

绝大多数醚类化合物都可以产生令人愉悦的香气[20]。在加工过程中，含量最多的醚类物质是甲醚，但是甲醚的阈值比较高，所以对风味的贡献就比较低，二烯丙基硫醚和烯丙基二硫醚是香料物质成熟过程中产生的[21]，其阈值较低，所以对卤烤兔肉丁的风味贡献率较大，可以对风味起到主体作用。

2.7 其他挥发性风味物质含量分析

其他类主要是一些吡咯、吡嗪类物质。呋喃类物质一般具有强烈的肉味和极低的气味阈值，呋喃也可能是煮熟的兔肉发出甜味和焦糖样气味的原因[18]，但是此次实验中并没有呋喃物质的出现。吡咯和吡嗪类物质主要是在二次调味和杀菌后成品阶段出现，吡嗪类物质是通过含氮物质在美拉德反应中生成的[22]，一般会在加工后期出现，所以通过控制烤制和二次调味等加工过程有利于促进有益挥发性风味物质的生成和抑制不良物质生成。

2.8 卤烤兔肉丁挥发性风味物质气味活性值分析

OAV≥1的挥发性风味物质对总体风味物质起到主体作用，对卤烤兔肉丁的风味起到较大的贡献，往往OAV值越大，就对总风味物质的贡献越大[23]。由表2可知，在卤烤兔肉丁加工过程中鉴定出对风味物质起主体作用的物质共有10种，其中醇类3种，醛类3种，烃类1种，酚类1种，醚类2种。在鲜肉阶段和腌制阶段只有1种醛类的OAV值大于1，即己醛，这就证明兔肉在鲜肉阶段的主体风味物质主要是腥味物质己醛，这与邓大川[15]的研究相符。在卤制阶段有5种起主体作用的风味物质，分别为芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、己醛、草蒿脑、烯丙基二硫醚。在烤制阶段有4种起主体作用的风味物质，分别为桉叶油醇、芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇和草蒿脑。在二次调味阶段有6种起主体作用的风味物质，分别为芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、壬醛、己醛、(+)-柠檬烯、草蒿脑。在成品阶段有8种起主体作用的风味物质，分别为芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、壬醛、异戊醛、己醛、(+)-柠檬烯、草蒿脑、二烯丙基硫醚。

在卤制、烤制、二次调味以及成品阶段均有芳樟醇(OAV范围为4.78～85.13)、2-丙烯-1-硫醇(OAV范围为1 301.35～2 807.58)和草蒿脑(OAV范围为48.13～150.30)的存在，并且其相对含量还比较大，对风味起到主体作用。以上3种气味活性物质的OAV较高，对卤烤兔肉丁的风味起到显著的贡献作用，被认定为卤烤兔肉丁的特征风味物质。一般在烤制加工过程中会伴随着一定量的脂肪氧化以及美拉德反应的发生，会导致醛类和吡嗪类化合物大量产生，但是因为一些吡嗪类物质的阈值较大，所以对卤烤兔肉丁的风味贡献不大。

表2 卤烤兔肉丁的主体风味物质(OAV≥1)Table 2 The main flavor substance of braised rabbit diced meat(OAV≥1)

2.9 卤烤兔肉丁加工过程中挥发性风味物质的主成分分析

主成分分析主要就是用较少的主要成分去解释原始数据中大部分情况，一般要求累积方差百分比达到85%[24]。对卤烤兔肉丁的6个加工过程中的10种主体风味物质(OAV≥1)进行主成分分析，其中PC1、PC2、PC3、PC4的方差贡献率分别为52.347%、18.958%、12.439%、11.779%，累积为95.523%，超过了85%，即这4个主成分能够代表7种主体风味物质95.523%的综合信息。卤烤兔肉丁中各挥发性风味物质对主成分的影响主要通过载荷系数来表示，一般载荷系数的绝对值越接近1，则表明该物质对主成分的贡献越大。所以，根据主成分分析可知，芳樟醇、壬醛、异戊醛、(+)-柠檬烯、草蒿脑和二烯丙基硫醚这6种风味物质在PC1中载荷系数较大，与PC1有较强的相关性；PC2与己醛和2-丙烯-1-硫醇这2种风味物质有较强的相关性；而PC3与桉叶油醇和烯丙基二硫醚这2种风味物质有较强的相关性。

如图1所示，在不同的加工阶段卤烤兔肉丁的挥发性风味物质存在较大的差异，鲜肉和腌制2个阶段都位于第三象限，与PC1和PC2呈负相关；卤制和烤制2个阶段都位于第二象限，与PC1呈负相关，与PC2呈正相关。结合图1和图2可知，己醛位于第三象限，且鲜肉和腌制阶段也位于第一阶段，也就可以说鲜肉和腌制阶段中的主要挥发性风味物质就是己醛；桉叶油醇和烯丙基二硫醚位于第二象限，说明这些物质是卤制和烤制阶段中的主要挥发性风味物质；二次调味和成品分别位于第一象限和第四象限，芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、(+)-柠檬烯和草蒿脑也位于第一象限，也就是说这些物质是二次调味的主要挥发性物质；壬醛、异戊醛和二烯丙基硫醚位于第四象限，说明成品中主要的挥发性风味物质就是壬醛、异戊醛和二烯丙基硫醚。进行主成分分析可以发现，不同加工过程中挥发性风味物质存在明显差异，不同加工过程中的风味物质能够得到良好的分离。

图1 不同加工过程中的PC1与PC2得分图Fig.1 Scores of PC1 and PC2 in different processing processes注：1～6分别代表6个加工阶段，即鲜肉、腌制、卤制、烤制、二次调味、成品

图2 卤烤兔肉丁主成分的载荷图Fig.2 Load diagram for principal component analysis of bittern roast rabbit diced meat注：V1～V10分别代表：桉叶油醇、芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、壬醛、异戊醛、己醛、(+)-柠檬烯、草蒿脑、二烯丙基硫醚、烯丙基二硫醚

3 结论

本研究主要采用了HS-SPME-GC-MS技术对卤烤兔肉丁加工过程中关键过程的挥发性物质变化进行检测分析，检测出加工过程中共存在137种挥发性物质，其中鲜肉、腌制、卤制、烤制、二次调味和成品中分别检出36、32、40、41、63和59种种挥发性物质。对卤烤兔肉丁中挥发性物质起主体作用的风味物质共10种，其中醛类3种、醇类3种、烃类1种、酚类1种、醚类2种。进行主成分分析发现，不同加工过程的挥发性风味物质存在差异，不同加工过程中起到作用的挥发性风味物质也存在差异。

本文以新开发的新型兔肉产品为研究材料进行研究，对兔肉产品的开发具有一定的参考意义，对未来兔肉制品行业有一定的进步性价值，但对加工过程中风味物质以及滋味物质的研究还不够全面，未来可继续在这方面进行研究。