多种渔用麻醉剂检测快速前处理方法的研究与建立

陆亦宽，徐迪，刘文悦，郭桂萍，卢瑛*，谢晶

1(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)2(上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海，201306)3(农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，上海，201306)4(中华人民共和国南通海关，江苏 南通，226000)

据《2020中国渔业统计年鉴》统计显示, 我国2019年水产品总产量达6 480.36万t, 水产行业持续蓬勃发展[1]。然而水产品的安全问题却屡见不鲜，目前水产品不合格的主要原因90%集中于兽药残留和重金属超标，兽药残留主要有硝基呋喃类、氯霉素类、孔雀石绿等[2-3]，给我国消费者的健康造成了严重危害。近年来，新兴兽药渔用麻醉剂因其价格低廉、使用方便、可以有效降低水产品在运输过程中产生的应激反应等优点[5-7]，越来越多的应用于活鱼运输过程中，构成了潜在的危害[8-10]。

目前，兽药残留和渔用麻醉剂的检测方法多为仪器分析方法[11]，例如气质联用法[12-14]、液质联用法[15-20]等，其样品前处理存在操作繁琐、耗时长、试剂消耗大、需要专业设备辅助处理等问题。例如LI等[13]采用10 mL乙腈，经冷冻离心、低温冷冻、氮吹耗时4 h以上制备鱼肉中的三卡因待测样品；XIE等[18]制备鱼肉中的孔雀石绿待测样品，需采用50 mL乙腈，经高速离心、氮吹等前处理耗时3.5 h。

当前对前处理的优化主要集中在提取和净化两方面。提取方面，传统的液-液萃取法虽易于实现，但存在试剂用量大的缺陷[12,19-20]，新兴的分散液-液微萃取技术则在此基础上显著地降低了试剂消耗问题，提取试剂用量从mL级别降低到了μL级别，并已成功应用于果蔬、牛奶等样品的检测[21]。净化方面，传统净化主要采用固相萃取柱消除基质干扰，简化研究主要集中在优化萃取柱使用流程或采用其他简便、效果相当的方法进行净化处理。如高平等[19]采用通过式固相萃取柱检测水产品中的渔用麻醉剂残留，免去了传统步骤中活化、淋洗、洗脱等步骤，且可以通过重力自然通过小柱而无需固相萃取装置；LI等[17]通过改良QuEChERS法检测鱼肉组织中的三卡因，通过优化提取剂、改变净化剂组成，处理时间在30 min内，回收率可达79.6%～119.7%。尽管目前样品前处理技术有了一定的发展，但仍存在依赖专业设备辅助、需专业人员操作及应用范围窄等问题。

本研究首先通过优化流动相、检测波长等条件建立了三卡因的HPLC检测方法，并应用在其他5种渔用麻醉剂的检测上。随后通过减少样品及提取试剂用量、降低前处理净化浓缩所需设备条件等途径建立了快速前处理工艺，再通过提取试剂用量、涡旋混合时间和净化剂用量的单因素优化，综合6种渔用麻醉剂的人工模拟样品检测和回收率评价，建立了一种适用于三卡因、2-苯氧乙醇、丙泊酚、丁香酚、乙酸丁香酚酯、苯佐卡因6种渔用麻醉剂检测的快速前处理方法。最后采用对加标样品和模拟麻醉运输大菱鲆的三卡因残留样品，通过HPLC和试纸条检测的应用，探讨了该前处理方法的适用性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

三卡因(纯度99.9%)，德国Dr公司；丁香酚(纯度99.9%)，德国Sigma公司；苯佐卡因(纯度98%)、2-苯氧乙醇(纯度98%)、乙酸丁香酚酯(纯度>98%)、丙泊酚(纯度98%)，上海源叶生物公司；乙腈、乙酸铵，均为HPLC级，上海麦克林生化科技有限公司；净化剂(50% MgSO4、20%乙二胺-N-丙基硅烷、20% C18、10%石墨碳)，深圳逗点生物有限公司。

Agilent Infinity 1260高效液相色谱仪及Agilent OpenLAB Control Panel 2010数据处理软件；涡旋振荡器，美国奥然科技公司；掌式离心机，美国赛洛捷克公司；恒温水浴锅，上海蓝豹实验仪器有限公司；电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；纯水仪，德国默克公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品配制

标准储备液配制：分别精确称取100.0 mg的三卡因、丁香酚、2-苯氧乙醇、苯佐卡因、乙酸丁香酚酯、丙泊酚标准品于10 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制为10 mg/mL的标准储备液。

1.2.2 样品前处理方法

经典前处理方法：通过手动斩拌机斩拌鱼肉，称取5.0 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈和均质子，涡旋振荡30 s后，超声10 min，在4 000 r/min条件下离心5 min，移取上层液体至活化后C18固相萃取柱，使用甲醇洗脱并收集2 mL洗脱液于10 mL离心管中，随后在40 ℃下氮吹至近干，用1 mL乙腈复溶，过0.22 μm 有机相膜后待HPLC分析。

简化前处理方法：通过手动斩拌机斩拌鱼肉，称取1.0 g样品于15 mL离心管中，加入1.5 mL乙腈和均质子，涡旋振荡2.5 min后，分别移取上层液体1 mL 至含有150 mg的4种常用净化剂(75 mg MgSO4、30 mg乙二胺-N-丙基硅烷、30 mg C18、15 mg石墨碳)的2 mL离心管中，涡旋振荡2 min后，于掌式离心机离心2 min，取上清液过0.22 μm有机相膜后待HPLC分析；随后取500 μL样品液于2 mL离心管置于50 ℃水浴锅中，用真空泵吹干后用10 mmol/L磷酸盐缓冲液复溶后，待试纸条检测。

1.2.3 HPLC分析参数的设置

采用DIKMA Diaminsil Plus C18-A柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流动相为乙腈-水，以V(乙腈)∶V(水)=7∶3的比例等度洗脱，流速0.6 mL/min，在220 nm下检测三卡因、丁香酚；在280 nm下检测苯佐卡因、乙酸丁香酚酯、丙泊酚和2-苯氧乙醇；柱温35 ℃，进样量10 μL。

1.2.4 三卡因HPLC检测方法的建立

流动相的选择：配制浓度为1、5、10 μg/mL的标准品，比较流动相组合为乙腈和水、乙腈和乙酸铵、乙腈和0.1%甲酸水(体积比)、甲醇和水、甲醇和 0.1%甲酸水的条件下三卡因响应值的大小。

检测波长的选择：配制质量浓度为1、5、10 μg/mL的标准品，比较检测波长为200、210、220、230、240 nm 的条件下三卡因响应值的大小。

1.2.5 三卡因快速前处理工艺的建立

1.2.5.1 快速前处理工艺的建立

采用乌鳢基质为加标样品进行前处理工艺优化，三卡因加标浓度为0.1、1、5 mg/kg。

称样量的优化：采用1.2.2中经典方法处理样品，通过HPLC检测，比较称样量1 g和5 g时回收率的差异。

提取和净化浓缩流程的简化：采用1.2.2中经典方法处理样品，并改变提取和净化浓缩流程，通过HPLC检测，比较两者回收率的差异。

1.2.5.2 快速前处理条件的优化

采用乌鳢基质为加标样品进行前处理条件的优化，三卡因加标浓度为0.1、1、5 mg/kg。

提取剂乙腈添加量的优化：按1.2.2中简化方法处理样品，通过HPLC检测，比较乙腈添加量为1、1.5、2 mL时回收率的差异。

涡旋混合时间的优化：按1.2.2中简化方法理处理样品，通过HPLC检测，比较涡旋混合时间为1.5、2、2.5、3 min时回收率的差异。

净化剂用量的优化：按1.2.2中简化方法处理样品，通过HPLC检测，比较净化剂用量为100、150、200 mg 时回收率的差异。

1.2.6 三卡因的快检试纸条检测

乌鳢样品采用1.2.2中简化方法前处理，三卡因免疫层析试纸条为实验室前期研制。检测方法如下：将4 μL磁纳米探针与100 μL样本混合后，振荡超声30 s，随后加入16 μL层析液[含5%(体积分数)吐温-20]、0.2～0.3 g/mL牛血清蛋白的磷酸盐缓冲溶液)，振荡超声30 s，将上述混合液滴加至试纸条样品垫上，层析反应后进行肉眼判断定性，磁信号仪精确定量。

1.2.7 渔用麻醉剂的前处理样品制备与检测

采用1.2.2中简化方法前处理加标水平为0.5、5、10 mg/kg的乌鳢、海鲈鱼和南美白对虾样品，加标渔用麻醉剂为三卡因、丁香酚、2-苯氧乙醇、苯佐卡因、乙酸丁香酚酯和丙泊酚，通过HPLC进行检测，评价回收率。回收率计算如公式(1)所示：

(1)

2 结果与分析

2.1 渔用麻醉剂的HPLC检测方法的建立

本研究通过优化检测波长和流动相组成建立三卡因HPLC检测方法。标准曲线如表1所示。检测波长方面，结果如图1-A所示，可以看到各个浓度下响应值从200 nm到220 nm渐渐上升，从220 nm之后响应值就开始下降，故而选择220 nm为最佳检测波长。流动相的优化结果如图1-B所示，可以看到在三卡因低质量浓度1 μg/mL时，各类流动相的响应值相近，随着浓度达5和10 μg/mL时，响应值差距拉大，乙腈-甲酸水和甲醇-甲酸水效果较差，乙腈-乙酸铵、乙腈-水和甲醇-水的响应值较好且相近，由于乙酸铵作为盐类会对色谱系统有一定的影响，因而进一步地对这乙腈-水和甲醇-水两组的柱效和拖尾因子进行评价。

柱效和拖尾因子体现了色谱峰的峰形好坏，影响着检测结果准确与否。如图1-C、图1-D所示，在拖尾因子方面，乙腈-水和甲醇-水效果基本相当，说明色谱峰峰形较尖锐；而在柱效方面，乙腈-水的柱效明显高于甲醇-水，说明有着更好的色谱峰性能，故而最后选择乙腈-水为流动相。

其他渔用麻醉剂在三卡因优化后的检测条件下进行检测，除丁香酚外，其他渔用麻醉剂检测波长有所调整，在280 nm检测波长下检测苯佐卡因、乙酸丁香酚酯、丙泊酚和2-苯氧乙醇。

表1 线性方程、相关系数及检出限与定量限Table 1 Linear equation, correlation coefficient, limit of detection and limit of quantification

A-三卡因检测波长的选择；B-三卡因检测流动相的选择；C-乙腈-水与甲醇-水柱效的比较；D-乙腈-水与甲醇-水的拖尾因子比较图1 三卡因HPLC检测优化条件及渔用麻醉剂色谱图Fig.1 Optimization of HPLC detection conditions of tricaine and chromatogram of fishery anesthetic

2.2 三卡因快速前处理方法的建立

2.2.1 乌鳢中三卡因的快速前处理流程简化

样品前处理主要包括样品提取和净化浓缩2个步骤，决定了前处理时间和复杂程度。基于此，本文参考多篇文献建立经典前处理方法，样品提取参考LI等[17]、XIE等[18]提取方法，采用乙腈作为提取剂，称样量5 g；净化流程参考了HUANG等[22]、高平等[19]净化方法，采用固相萃取柱净化和氮吹浓缩。本研究主要针对样品提取和净化浓缩的流程进行了简化，降低了处理难度和所需时间，主要改变如图2所示。

传统兽药前处理技术通常采用10 mL以上的提取试剂，这就导致后续操作需要大型离心机辅助以及更长的净化浓缩耗时，例如固相萃取柱的过柱时间延长，氮吹仪的氮吹时间延长，这些因素叠加在一起致使样品前处理时间变长、成本增加。本研究首先针对样品提取流程进行优化，主要包括样品用量的减少和所需设备条件的简化，将样品用量降低至1 g，以便使用更少的提取试剂1.5 mL，使得后续操作可在2 mL离心管中使用，实现了便携掌式离心机代替了大型离心机的简化。然后本研究针对样品的净化浓缩流程进行改良，采用QuEChERS法结合水浴锅真空泵有效缩短了净化浓缩所需时间，避免了传统的固相萃取装置和氮吹仪的使用，更便于实现现场检测需求，将净化耗时从1.5 h压缩至10 min内。最后，将简化后的提取和净化浓缩流程结合，与经典前处理方法对比，验证快速前处理流程简化的可行性。具体见图2。

图2 前处理流程简化示意图Fig.2 Diagram of simplified pretreatment process

如图3所示，可以看到在低中高3个加标浓度下，流程简化前后三卡因的回收率较为相近。如图3-A所示，样品量的变化对于加标回收率基本没有影响，说明降低称样量和提取剂用量的思路可行；如图3-B 和图3-C所示，将提取流程和净化流程简化后，加标回收率有所下降，但最大相差不超过5%，说明单纯的涡旋振荡可以代替涡旋与超声联用的提取方式，而水浴结合真空泵吹干的方式可以代替传统氮吹。图3-D显示了在相同加标浓度下，传统前处理流程和简化前处理流程的回收率相近，且简化前处理流程的相对标准偏差虽大于传统前处理流程，但仍在8%以内，说明简化前处理流程稳定性较好，可以代替传统前处理流程。

A-样品量变化前后三卡因回收率比较；B-提取流程简化三卡因回收率比较；C-净化流程简化三卡因回收率比较；D-传统前处理与简化前处理方法比较图3 传统前处理流程简化后的比较Fig.3 Comparison of simplified traditional pretreatment processes

2.2.2 三卡因前处理工艺优化

为了减少提取试剂的使用量，对微量提取试剂(1～2 mL)进行了优化。如图4-A所示。提取试剂体积为1.5 mL时在各加标浓度下的回收率最佳，而1 mL效果较差，其原因可能是因为提取试剂用量较少，致使回收过程中损失较大，王铮等[23]在降低孔雀石绿提取试剂用量也遇到类似问题，过少的提取试剂可能导致假阴性结果的出现，而2 mL的回收率与1.5 mL相近，这可能是提取试剂饱和所致[15]。

因净化时采用的是2 mL离心管，故此净化剂用量不能太多。如图4-B所示，当商用净化剂用量为100～300 mg时，回收率先上升后下降，可能是因为较少的净化剂净化效果不佳。 LI等[17]优化三卡因前处理时的研究表明过少的净化剂会有更明显的基质效应，而过度的净化剂则会导致非特异性吸附，从而使回收率下降；实验过程中观察到过多的净化剂会有结块现象，这可能是由于净化剂中含有MgSO4，该盐有较好的吸水效果，但吸水后会产生水合硫酸镁晶体，导致结块现象，这与PERESTRELO等[24]描述相近，从而影响了待测物的提取，故而最佳净化剂用量为150 mg。如图4-C所示，涡旋时间小于1.5 min时回收率在80%以下，回收效果较差；涡旋混合1.5 min 以后回收率逐步趋于稳定，在加标量为1和5 mg/kg时，混合2.5和3 min的回收率相近，因此选择2.5 min为最佳涡旋混合时间。

综上，三卡因最佳前处理工艺条件为乙腈用量1.5 mL，净化剂添加量150 mg，涡旋混合时间2.5 min。

2.3 三卡因快速前处理方法的应用与推广

2.3.1 快速前处理方法在多种渔用麻醉剂前处理中的应用

依据三卡因优化后的样品前处理条件，对三卡因和其他渔用麻醉剂丁香酚、2-苯氧乙醇、苯佐卡因、乙酸丁香酚酯和丙泊酚进行加标回收实验，加标样品为乌鳢、海鲈鱼和南美白对虾。由图5可知，6种渔用麻醉剂的回收率在0.5、5、10 mg/kg的添加水平下，回收率均在80%以上,说明本法有较好的应用性。苯佐卡因在3种基质中的回收率与三卡因相近，在0.5、5、10 mg/kg 3个水平下回收率均在95%以上，这可能是由于苯佐卡因与三卡因结构相近，故而有相近的表现[6]。丁香酚在海鲈鱼和乌鳢中的回收率表现类似，均是在0.5、10 mg/kg回收率较高，在5 mg/kg时回收率较低，而在虾肉基质中则依加标量大小回收率依次增加，这可能是由于基质效应不同所导致的乙酸丁香酚酯和丙泊酚较其他4种渔用麻醉剂整体回收率偏低，尤其在0.5 mg/kg 的加标量下，回收率在82.08%～85.76%，这可能是两者的HPLC定量限较高导致，乙酸丁香酚酯和丙泊酚的定量限分别为0.683 mg/kg和0.414 1 mg/kg，接近0.5 mg/kg，导致其回收率较低，也可能是未采用最佳的提取试剂，据颜珲璘等[25]报道丙泊酚最佳提取试剂为乙酸乙酯；而乙酸丁香酚酯相较于其他麻醉剂回收率较低这与翟纹静等[5]的研究相近。

A-乙腈添加量对于回收率的影响；B-净化剂用量对于回收率的影响；C-涡旋时间对比回收率的影响图4 三卡因前处理条件优化Fig.4 Optimization of pretreatment conditions for tricaine

2.3.2 三卡因快速前处理方法在试纸条检测中的应用

为了验证简化后前处理方法的普适性，以乌鳢为加标样品，制备加标水平为 0.5、5、10 mg/kg的加标样品；此外以大菱鲆为模拟麻醉对象，在三卡因质量浓度为30 mg/mL的水中模拟运输24 h，每隔6 h取样1次，样品为鱼肉。所有的样品经简化前处理后，通过HPLC和实验室自研的三卡因试纸条进行检测并对比结果。如图6-A 所示，可以看到在不同加标浓度下，试纸条检测结果与HPLC相近，最大偏差在5%以内，说明简化后的前处理方法可以用于试纸条检测。从图6-B中可以看到，实际样品的HPLC和试纸条检测结果类似，表明本研究所建立的样品前处理方法适用于这2种方法，具有较好的应用前景。

A-乌鳢；B-海鲈鱼；C-南美白对虾图5 三种基质中6种渔用麻醉剂的加标回收率Fig.5 The recoveries of six kinds of fishery anesthetics in three kinds of substrates

A-加标样品检测结果对比；B-实际样品检测结果对比图6 免疫层析试纸条与HPLC检测结果对比Fig.6 Comparison of results between immunochromatographic strip and HPLC

3 结论

本研究通过减少样品和提取试剂的用量，降低了前处理设备的需求，将前处理时间控制在20 min内，建立了一种渔用麻醉剂快速前处理方法，可应用于其他多种渔用麻醉剂及多种基质的前处理中。本研究所建立的前处理方法不仅适用于HPLC分析，还可以用于快检试纸条检测，为其他兽药快速前处理方法的开发提供了一种思路，为现场检测和实验室监控提供了技术支撑。