柚皮素对脑缺血损伤小鼠神经细胞线粒体自噬的影响实验研究

王凯华，杨鑫勇，郑光珊，陈真珍，覃 辉，黄建民

(1.广西国际壮医医院，广西 南宁 530201；2.广西中医药大学，广西 南宁530200；3.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011)

脑卒中是一种严重危害人类生命健康的疾病，其中缺血性卒中约占85%。我国缺血性卒中的发病率远高于西方国家，近年来其发病率、复发率、致残率和病死率明显增高，且发病年龄逐步年轻化，给家庭和社会带来了沉重的经济负担。本病病理基础多为动脉粥样硬化，脑组织血液供应障碍，导致局部脑组织缺血缺氧和坏死。目前研究表明缺血性卒中时，神经细胞损伤受炎症[1]、细胞凋亡[2]、兴奋性氨基酸毒性[3]、氧化应激等途径调控[4]，而近年来越来越多的研究发现线粒体自噬是脑缺血病理过程中重要的保护机制,已成为脑缺血损伤潜在的治疗靶点[5]。

缺血性卒中属于中医学中风病范畴，其病机不外“风、火、痰、瘀、虚”五端，属于难治性疾病的范畴，其病机为年老体衰，或久病气血亏虚。临床上缺血性中风风痰阻络证多见，且常夹湿、夹瘀，临床以经典方剂温胆汤治疗中风风痰阻络证获得良好疗效。枳实以其破气消积、化痰散痞，陈皮以其理气健脾、燥湿化痰之功入伍温胆汤方中。柚皮素(Naringenin)属于二氢黄酮类化合物，是传统中药枳实、陈皮中的重要有效成分[6]。近年来研究发现柚皮素具有较好的抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用，容易穿透血脑屏障，在减轻脑缺血再灌注损伤中发挥了重要的作用。但柚皮素减轻脑缺血损伤的作用机制是否与调控线粒体自噬有关，目前尚不明确。因此，本研究拟通过细胞和动物实验探索柚皮素调控线粒体自噬途径对小鼠脑缺血后神经细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 出生6～7周的SPF级C57BL/6J小鼠，体重19.4～21.4 g，由广西中医药大学动物实验中心提供，动物生产许可证号:SCXK(湘)2019-0004。本实验经本校伦理委员会批准，符合3R原则，伦理编号：DW20210411-075。饲养条件：同周龄小鼠10只/笼，温度22～25 ℃，湿度70%～75%，自由饮水、进食，光照周期12 h∶12 h。

1.2 主要试剂 柚皮素(N164488)，Mdivi-1抑制剂(HY-15886)，强效裂解液(00020210315)，BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，上海缘叶生物科技有限公司)，Tomm20、Timm23、LC3I/Ⅱ、 Cyt C、Caspase3等一抗(武汉三鹰生物技术有限公司)，P62、BNIP3一抗(ABclonal)；GAPDH、山羊抗兔血清二抗(美国，Abcam)，二甲基亚砜 (DMSO，000020210315)。

1.3 仪 器 1659001型蛋白电泳仪、Trans-Blot SD 型半干转膜仪(Bio-Rad)，低温冷冻离心机(珠海黑马)，微量分光光度计(北京凯奥)，透射电子显微镜(Hitachi)，摇臂显微镜、解剖显微镜由广西中医药大学实验动物中心提供，Bio-Rad 化学发光成像仪由广西中医药大学科学实验中心公共平台提供。

1.4 实验方法

1.4.1 动物实验

1.4.1.1 实验分组：小鼠190只，分为空白组10只，假手术组30只，模型组30只，溶剂组30只，柚皮素组30只，Mdivi-1 抑制剂组30只，抑制剂+柚皮素给药组30只。除空白组外，其余各组均以1、3、7 d三个时间点进行结果检测。

1.4.1.2 药物制备及给药方式:依次向柚皮素药品粉末中加入10% DMSO,40% PEG300,5%Tween-80+0.9%氯化钠溶液,制备澄清的柚皮素(30 mg/kg，0.2 ml/10 g)、抑制剂(50 mg/kg，0.2 ml/10 g)以及柚皮素联合抑制剂溶液，每次给药前配制。每天早10时，每组动物以10%葡萄糖水0.2 ml/10 g灌胃，空白组除外。下午4 时每组腹腔注射给药，空白组除外，假手术组及模型组予0.9%氯化钠溶液腹腔注射，溶剂组予不含药的溶剂腹腔注射。

1.4.1.3 小鼠脑缺血再灌注损伤模型的建立：参照文献方法，采用经典的大脑中动脉栓塞法(MCAO) 制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型[7-8]。每只大鼠均缺血2 h，再灌注24 h后用于实验。雄性C57小鼠，七氟烷持续吸入麻醉，去除颅骨表面组织，接入激光多普勒血流检测仪，置于显微镜下，切开小鼠颈部正中，暴露右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)，游离CCA至分叉处，结扎后剪断ECA分支。在距离ECA根部5 mm左右结扎并剪断ECA。在ECA远端剪开一个小缺口，边松开动脉夹，边将线栓(直径约0.3 mm)送入ICA，阻断右侧大脑中动脉(RMCA) 起始处血流，多普勒检测RMCA血流下降至20%则提示RMCA栓塞成功。缝合后把小鼠放在保温箱中。栓塞2 h时取出线栓。假手术组采用相同的操作方法，不插入线栓。

1.4.1.4 小鼠神经功能缺损测定：再灌注24 h后，采用Bederson评分对小鼠进行神经功能损伤评定，总分为5分。0分：无神经功能缺损症状；1分：小鼠不能完全伸展对侧前爪；2分：小鼠侧推抵抗力下降，并伴向对侧转圈行为；3分：小鼠向对侧倾倒；4分：小鼠不能自行行走，意识丧失。评分越高则小鼠神经功损伤越严重。

1.4.1.5 小鼠脑梗死体积测定：采用TTC法测定脑梗死体积。分别取各组小鼠，腹腔麻醉后断头取脑，用0.9%氯化钠溶液冲洗，置于-20 ℃冰箱中速冻20 min，取出后，行冠状大脑切片，2 mm/片，将切片置于1%TTC中，避光，37 ℃温孵20 min，每隔7～8 min 翻动1次，染色后以4%多聚甲醛固定。拍照后用图像分析系统进行分析处理，采用积分法计算梗死体积占全脑体积的百分比。

1.4.1.6 电镜观察小鼠线粒体结构和线粒体自噬体分布：各组小鼠于造模后1、3、7 d三个时间点取标本，将脑组织浸泡在电镜固定液中。取1 mm3小块组织，快速放入电镜固定液中，在4 ℃下固定2 h。0.1 mol/L PBS(PH 7.4)洗3次，每次15 min。然后用1%的锇酸0.1 mol/L PBS(pH 7.4)室温下固定2 h。脑组织依次置于梯度乙醇，100%丙酮中脱水，15 min/次。包埋后，将样品插入包埋板后37 ℃烤箱过夜。60 ℃烤箱聚合48 h，使用超薄切片机切制 60～80 nm 超薄切片。铀铅双染色，切片置于室温中干燥过夜，电子显微镜进行观察，采集图像进行结果分析。

1.4.2 细胞实验

1.4.2.1 皮层神经元培养：参照文献的方法进行小鼠皮层神经细胞的培养[9]。

1.4.2.2 实验分组：正常组为小鼠皮层神经元正常培养；模型组：正常培养神经元糖氧剥夺/再灌注后继续培养48 h；模型+柚皮素组：正常培养神经元糖氧剥夺/再灌注后用含80 μmol/L柚皮素的培养基继续培养48 h；正常+柚皮素组：正常培养神经元加用含80 μmol/L 柚皮素的培养基继续培养48 h;模型+抑制剂组：正常培养神经元糖氧剥夺/再灌注后立即用含Mdivi-1的培养基继续培养48 h；柚皮素+抑制剂组：正常培养神经元糖氧剥夺/再灌注后立即加入Mdivi-1，用含80 μmol/L柚皮素的培养基继续培养48 h。

1.4.2.3 小鼠皮层神经元糖氧剥夺/再灌注模型(OGD/R)的建立：参照神经细胞缺血再灌注模型制作方法[9],取培养7 d的神经细胞,吸去原培养液,用无糖Earle’s液清洗两遍后加入无糖Earle’s液维持。将细胞培养皿置于可通气的低氧细胞培养罐内,向罐内缓慢通入含有95% N2和5% CO2的混合气体以排除罐内原有的空气,从而降低氧气浓度。正压填充30 min后形成低氧环境,关闭气罐,拔掉罐盖气体进出连接管,置于恒温培养箱内(氧糖剥夺,体外模拟缺血缺氧)。90 min后取出缺氧罐,吸去无糖Earle’s液,换回细胞维持培养液,放入恒温细胞培养箱中继续正常培养(复糖复氧,体外模拟再灌注)进行后续实验。

1.4.2.4 MTT法检测细胞活力：无菌环境下，取出各组细胞培养板，吸弃各孔内培养基，PBS 洗涤各孔3次，各孔内依次加入已配制好的10% MTT溶液，水平晃匀后，放回细胞培养箱内继续孵育约 4 h。轻缓吸弃各孔内细胞溶液，并向各孔内加入150 μl DMSO，再继续进行孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan已全部溶解而未见晶体样物质存在。最后，于酶标仪570 nm波长处测定各孔吸光度值并记录数值。

1.4.2.5 电镜观察各组细胞线粒体结构和线粒体自噬体、线粒体自噬溶酶体分布:参照文献方法制作小鼠皮层神经细胞切片，铀铅双染色，切片置于室温干燥过夜，透射电子显微镜下观察，采集图像进行结果分析。

1.4.2.6 Western blot检测细胞质与线粒体内TOMM20及COX4I1、P62、自噬标记物LC3水平和Cyt C水平:Western blot参照文献的研究方法[8]。使用细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA进行蛋白定量，用15%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转移至VADF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗(兔抗鼠多克隆抗体，1∶1000)，4 ℃过夜。TBST清洗3次，加入二抗(羊抗鼠单克隆抗体，1∶3000)，室温孵育1 h，TBST洗涤后，用化学发光显色法显影，定影，洗片。用Image J图像处理软件分析条带的灰度值并进行统计分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行分析。数据以均数±标准差进行统计描述，组间比较采用单因素方差分析；P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物实验结果

2.1.1 柚皮素对小鼠脑缺血后神经功能缺损的影响：见表1。假手术组和空白组均为0分。各时点模型组与溶剂组之间神经功能缺损评分比较差异均无统计学意义(P>0.05)。1 d时，柚皮素组评分低于模型组、溶剂组，差异有统计学意义(P<0.05)。3 d时，柚皮素组评分与模型组、溶剂组相比明显降低，差异有统计学组意义(P<0.05)。7 d时，柚皮素组评分为0，与模型、溶剂组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.1.2 柚皮素对小鼠脑缺血后脑梗死体积的影响：见表2(图1)。假手术组与模型组、溶剂组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。各时间点，模型组与溶剂组之间脑梗死体积比较，差异无统计学意义(P>0.05)，柚皮素组脑梗死体积明显低于模型组、溶剂组，柚皮素组与模型组、溶剂组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组小鼠脑梗死体积比率比较(%)

图1 TTC染色法检测各组小鼠脑梗死情况

2.1.3 柚皮素对小鼠线粒体结构和线粒体自噬体分布的影响：空白无图组、假手术组线粒体结构正常，未见线粒体自噬体形成。模型组、溶剂组均可见部分线粒体轻度肿胀，膜密度增加，少量线粒体自噬现象。柚皮素组细胞浆可见大量自噬体形成，部分线粒体肿胀、空泡变性，线粒体膜膜密度增加，大量线粒体自噬，其自噬程度1 d<3 d<7 d。Mdivi-1抑制剂组可见部分线粒体轻度肿胀，膜密度增加，细胞胞浆偶见少量线粒体自噬，少量自噬体形成。柚皮素+抑制剂组可见少量线粒体自噬现象，少量线粒体部分轻度肿胀，部分线粒体嵴排列紊乱，细胞胞浆偶见自噬体形成。随着给药时间的增加，线粒体自噬率随之增加(图2)。

图2 各组电镜线粒体微观结构(×5000)

2.2 细胞实验结果

2.2.1 小鼠原代皮层神经元培养结果：小鼠原代皮层神经元培养结果显示，神经细胞胞体饱满,突起相互交织成网络,细胞状态良好(图3)。

A:贴壁培养1 d的皮层神经元(×100)；B、C:贴壁培养7 d的皮层神经元(×200)；D:贴壁培养皮层神经元及经NSE荧光染色(×100)

2.2.2 MTT法检测细胞活力：见表3。MTT法检测神经细胞细胞活力，在0、1 d时，各组之间细胞活力比较差异无统计学意义(P>0.05)。3、7 d时，各组间细胞活力皆与0 d时比较差异有统计学意义(P<0.05)。3 d时，其余各组与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)；除正常组外，其余各组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。至7 d时，各组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；除正常组外，其余各组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组间MTT法细胞活力比较(%)

2.2.3 电镜观察小鼠神经细胞线粒体结构和线粒体自噬体分布：空白组线粒体结构正常，偶可见极少数线粒体自噬体形成，正常+柚皮素组结果同空白组一致。模型组可见部分线粒体轻度肿胀，膜密度增加，少量线粒体自噬现象。柚皮素组可见胞浆内大量髓样小体、自噬体形成，线粒体膜欠完整，膜密度增加。模型+抑制剂组可见少部分线粒体轻度肿胀，膜密度增加，细胞胞浆仅偶见少量线粒体自噬体形成。柚皮素+抑制剂组可见少量线粒体部分轻度肿胀，少数线粒体膜密度轻度增加，细胞胞浆偶见髓样小体、自噬体形成(图4)。

图4 电镜观察小鼠神经细胞线粒体微观结构(×5000)

2.2.4 Western blot检测细胞质与线粒体内TOMM20及COX4I1、P62、自噬标记物LC3水平和Cyt C水平：见图5。正常+柚皮素组自噬相关蛋白P62、LC3、COX4I1、TOMM20表达水平高于柚皮素组，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组与模型+抑制剂组自噬相关蛋白表达水平均低于柚皮素组，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。模型+柚皮素组自噬相关的蛋白表达水平均高于模型组与模型+抑制剂组，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。柚皮素+抑制剂组自噬相关蛋白表达水平较模型+抑制剂组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。模型+抑制剂组细胞质内的细胞损伤标准蛋白Cyt C表达水平明显高于其他组，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

图5 各组细胞自噬相关蛋白表达情况

3 讨 论

缺血性脑卒中属于临床神经内科常见疾病，是指脑血栓形成或在脑血栓的基础上导致脑梗死而引起的神经功能缺损，如偏瘫和意识障碍等一系列相关病症[10]。现代医学认为，本病病理基础多为动脉粥样硬化，脑组织血液供应障碍，导致局部脑组织缺血缺氧和坏死[11]。如何尽快恢复脑组织血供，防止缺血再灌注损伤，挽救神经元，恢复其功能是治疗的关键。从中医理论出发，缺血性脑卒中相当于中医学的“中风”等疾病，属于难治性疾病的范畴，其病机为年老体衰，或久病气血亏虚，元气耗伤，脑脉失养，气虚不能运血，血液运行不畅，经脉失养，脑脉不充，导致气滞、血瘀或津阻痰凝，痰瘀互结阻脉，脑脉失养，虚实夹杂，正虚邪恋，导致疾病缠绵难愈[12]。《难经·八难》说：“气者，人之根本也”，气虚则气化功能障碍，脾胃不能化生水谷精气，水谷精气不能转化为营气和津液，则血无以化生，从而导致血脉空虚。《素问·玉机真藏论篇第十九》也指出:“气虚身中卒至，五脏绝闭，脉道不通”。王清任根据自己的实践认为“无论外感、内伤……所伤者无非气血”，元气虚不能达于血管，血液无气推动，必停而留瘀，指出半身不遂主因在于元气虚损。治疗当标本兼治，急性期以祛邪为主，虚实夹杂者宜攻补兼施。

研究表明柚皮素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降脂、降血糖等药理作用[6]。最近有研究发现柚皮素干预对永久性脑缺血大鼠模型动物具有神经保护作用[13],摄入含有柚皮素作为活性成分的枳实、陈皮可能有助于预防缺血性卒中[14]。我们团队前期发现柚皮素通过增强脑缺血小鼠脑内NRF2基因的表达，阻止线粒体去极化，促进线粒体自噬，从而减轻小鼠脑缺血再灌注损伤[15-16]。

本研究结果表明，脑缺血再灌注损伤1、3、7 d后，柚皮素组小鼠与模型组和溶剂组相比，神经功能缺损评分降低，神经功能缺损程度减轻，脑梗死体积缩小。3、7 d时柚皮素+模型组神经元细胞活力较模型组明显增强。以上结果表明柚皮素可以有效减轻小鼠脑缺血再灌注损伤，具有较好的神经保护作用。

最新研究表明，线粒体功能失调是加重造成脑缺血再灌注不可逆损伤的主要因素之一。线粒体是进行能量代谢、维持氧化还原平衡的重要细胞器，是脑缺血后神经细胞死亡的关键靶区，也是决定神经细胞能否存活的关键因素[17-19]。脑缺血可以诱导缺血区神经细胞发生线粒体自噬,过程中进一步激活线粒体自噬可产生显著的神经保护作用[20]。本研究通过透射电镜观察脑缺血小鼠神经细胞线粒体结构变化和线粒体自噬体分布情况，结果表明脑缺血会引起神经细胞线粒体肿胀，线粒体自噬增加。柚皮素组可引起神经细胞内大量线粒体自噬，线粒体自噬程度随时间增加而增强，线粒体抑制剂可抑制线粒体自噬。柚皮素组细胞自噬相关蛋白P62、LC3、COX4I1、TOMM20表达水平高于正常组，模型组细胞自噬相关蛋白表达水平高于模型+抑制剂组，柚皮素+Mdi组自噬相关蛋白表达水平较模型+抑制剂组升高，说明柚皮素可促进线粒体自噬，柚皮素对脑缺血损伤后神经细胞的保护作用可能是通过激活线粒体自噬实现的。

综上所述，本研究通过动物及细胞实验表明，柚皮素可以有效减轻小鼠脑缺血再灌注损伤，发挥神经保护作用，其机制可能是通过激活并增加线粒体自噬，线粒体自噬具有显著的神经保护作用。本研究的结果对于进一步开发有效的神经保护制剂提供了客观依据。