宫颈HR-HPV感染与阴道菌群失调及酸碱度的关系研究

臧文红，杜洪灵，蔡骁垚，金姝1，

1.南华大学衡阳医学院，湖南衡阳 421001；2.上海市普陀区人民医院妇产科，上海 200060；3.上海市普陀区人民医院中心实验室，上海 200060

众所周知，宫颈高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）持续感染会导致90%以上的宫颈癌，而对导致宫颈HR-HPV 持续感染的原因尚不清楚，国内外大量的研究发现阴道乳酸菌减少、细菌多样性增加与其有密切关系[1-2]，罕见报道阴道酸碱度变化对其影响。足够的证据表明酸化作用对单纯疱疹病毒、淋球菌等性传播病原体及细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）相关厌氧菌都有明确的杀灭抑制作用[3-4]。HR-HPV 是阴道众多病原菌之一，他们有共同的阴道环境。本研究选取2019 年4—8 月上海市普陀区人民医院妇科门诊要求体检的符合入选条件的女性150 例，剔除阴道细菌DNA提取扩增不达标样本后以102例样本测序纳入研究，分析宫颈HR-HPV 感染、阴道菌群、酸碱度三者之间的关系，以期探讨HR-HPV 持续感染的原因，为清除HPV 感染提供新思路。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取上海市普陀区人民医院妇科门诊要求体检的女性150 例。研究经上海市普陀区人民医院医学伦理委员会批准，所有研究对象知情同意。根据宫颈HR-HPV检测结果将至少检出1种HR-HPV者定义为HPV 阳性，未检出HR-HPV 者定义为HPV 阴性。将成功测序的102 例患者分为HPV 阳性组（n=37）和HPV 阴性组(n=65)。HPV 阳性组20～52 岁，平均年龄（33.08±9.12）岁；HPV 阴性组23～51 岁，平均年龄（35.77±8.10）岁。两组年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。具有可比性。阴道液pH≤4.1 为正常，pH≥4.4为升高。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①月经规律，有性生活史，年龄＞18岁；②月经干净1 周,无性生活，无阴道冲洗上药；③近1 个月无全身或局部应用抗生素、激素；④无外阴瘙痒，无白带增多、异味，无阴道异常出血；⑤无宫内节育器。排除标准：①妊娠妇女；②糖尿病患者及肝肾功能不全患者；③有恶性肿瘤史患者。

1.3 方法

①样本采集：用一次性无菌扩阴器扩张阴道，充分暴露宫颈，用无菌棉拭子绕宫颈旋转擦拭阴道穹隆3 周，采集时禁忌碰触其他部位避免污染。采集好的拭子放置在干燥无菌试管中置于阴凉干燥处，2 h 内剪切下棉头置于专用试管内转移至-80℃液氮冰箱冻存。之后取一根棉拭子置于阴道穹隆浸湿，取出后转移至pH 试纸，比色并记录pH 值。最后取专用无菌刷按说明书采集宫颈细胞样本保存，送该院病理科行HR-HPV 检测。②宫颈HR-HPV 检测：使用上海之江生物科技股份有限公司出品的HPV分型核酸测定试剂盒，采用实时荧光PCR 技术，按照说明书分型检测16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82 共计15 个亚型。③阴道pH 值测定：使用上海三爱思试剂有限公司生产的pH3.8～5.4 精密试纸。④阴道细菌DNA 提取、PCR 扩增、测序：将-80℃冰箱标本批量取出后，放置干冰转运箱中，运送至上海鲸舟基因科技有限公司。标本解冻、离心后按标准流程抽取DNA，对16s rDNA 的V3+V4区扩增，PCR产物经检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。仅以评级A 的样本102 个进行下一步测序。PCR 试验采用Trans-Gen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 µl 反应体系。参照Illumina 测序平台的正规操作步骤，将纯化定量后的扩增产物构建Miseq 文库，使用Illumina 公司的测序平台Miseq PE300 进行测序，比对Silva132/16s-bactera 数据库，采用RDP classifer 贝叶斯算法对97%相似水平的OTU 代表序列进行物种注释，并在门、纲、目、科、属各个分类水平统计每个样本的群落组成。丰度＜0.01%的物种合并为其他。

1.4 观察指标

①比较两组阴道微生物群落物种组成、丰度和多样性差异。计算样本菌群丰度的指数有Chao、Ace，用来估计物种总数；用来估算样本中微生物多样性的指数有Shannon、Simpson，Shannon 指数越大，物种多样性越高，Simpson指数则相反。本测序覆盖率99.9%；②阴道酸碱度升高、HPV 感染、阴道菌群结构三者的关系。

1.5 统计方法

利用R 软件分析作图，物种累积曲线判断样本量充分，稀释曲线判断样本测序数据量合理。α 多样性指数（chao、ace、shannon、simpson）分析判断样本微生物群落的丰度和多样性。根据OTU 注释结果分别在门、纲、目、科、属各个分类水平统计组间物种组成和相对丰度，使用R 软件用Wilcoxon 秩和检验分析判断组间菌种差异。采用SPSS 20.0 统计学软件处理数据，计量资料符合正态分布，方差相等，采用（±s）表示，组间比较进行t检验。计数资料采用[n(%)]表示，组间比较进行χ²检验或Fisher 确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组阴道细菌菌群丰度和多样性比较

两组阴道菌群丰度和菌群多样性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组阴道细菌菌群丰度和多样性指数比较(±s)

表1 两组阴道细菌菌群丰度和多样性指数比较(±s)

指数Ace Chao Shannon Simpson HPV阳性组（n=37）92.154±54.156 83.274±55.891 1.178±0.558 0.483±0.236 HPV阴性组（n=65）93.686±64.934 83.577±61.471 1.039±0.579 0.542±0.237 t值-0.121-0.025 1.182-1.211 P值0.904 0.980 0.240 0.229

2.2 两组阴道细菌物种组成

两组阴道细菌在门水平的物种组成：HPV 阳性组和HPV 阴性组都以厚壁菌门为主（76.91% vs 80.82%）（P=0.197），其次是放线菌门（13.24% vs 11.51%）（P=0.099）、变形菌门（2.94% vs 4.30%）（P=0.862）、拟杆菌门（3.89% vs 1.96%）（P=0.405）和梭杆菌门（2.57%vs 1.01%）（P=0.469）。差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 两组样本门水平物种组成柱状图

两组阴道细菌在属水平的物种组成：HPV 阳性组和HPV 阴性组均以乳酸杆菌为主，占比接近（73.60% vs 75.37%）（P=0.221）。其次是加德纳菌（10.37% vs 7.48%）（P=0.073）、小球藻（3.50% vs 1.46%）（P=0.181）、斯内西亚菌（2.56% vs 1.00%）（P=0.264）、奇异菌（2.46%vs 1.09%）（P=0.051）等厌氧菌属，HPV 阳性组较HPV 阴性组占比增多，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2 两组样本属水平物种组成柱状图

2.3 阴道菌群结构类型与阴道PH 和HPV 感染的关系

根据细菌16SrRNA 高通量测序的结果，将属水平菌种占比＞50%者定义为优势菌，将阴道群落结构分为3 种类型：Ⅰ乳酸杆菌优势型79 例（77.45%）；Ⅱ厌氧菌优势型17 例（16.67%），包括加德纳菌优势11 例，双歧杆菌2 例，链球菌1 例，志贺菌1 例，斯内西亚菌1 例，shuttleworthia 1 例；Ⅲ无优势菌型6 例（5.88%），见表2。

表2 阴道菌群类型、pH与HPV感染的关系

阴道菌群结构与阴道酸碱度：随乳酸杆菌减少阴道pH升高，乳酸菌优势型与非乳酸菌优势型相比[10.13%（8/79）vs 60.87%（14/23）]，差异有统计学意义（χ²=24.197，P＜0.001）。

阴道菌群结构与HPV感染：乳酸菌优势型和非乳酸菌优势型HPV感染率相比[35.44%（28/79）vs 39.13%（9/23）]，差异无统计学意义（χ²=0.105，P=0.746）。

HPV 感染与阴道酸碱度：pH 升高者较pH 正常者HPV 感染率增加[50.00%（11/22）vs 32.50%（26/80）]，但差异无统计学意义（χ²=2.286，P=0.131）。

3 讨论

3.1 宫颈HR-HPV感染与阴道乳杆菌优势

阴道与体外相通，正常女性阴道内有多种微生物存在。利用对细菌16SrRNA 高通量测序技术，2011 年Ravel 等[5]以占比50%以上的菌群为优势菌，首次将健康育龄妇女的阴道菌群分为5 种类型（community state types，CST）：CSTⅠ、CSTⅡ、CSTⅢ和CSTⅣ四型均以乳酸杆菌为优势菌，CSTⅣ型无优势菌。大多数人以少量乳杆菌为主，CSTⅣ型菌群结构在少数健康女性中出现，种族地域存在差异[6]。成熟健康女性的阴道环境因性激素周期变化、月经血冲刷和性交等因素动荡复杂，乳酸菌优势和CSTⅣ互相转化，但往往恢复较快，并不出现微生物群落多样性的增加和乳酸水平的下降[7-8]。近期报道的一项跨度长达24 年的前瞻性研究，对比分析宫颈HPV16 获得、持续、清除不同状态阴道菌群变化发现，是否感染HPV16 阴道菌群多样性并无差异，如果阴道环境长期不稳定，更多停留在CSTⅣ，则易发展为HPV 持续感染[9]。也有研究认为宫颈HPV 感染与阴道乳杆菌减少，菌群丰度和多样性增加显著相关[10-11]。本研究中HPV阳性和HPV阴性均以乳酸杆菌占主导地位，菌群丰度和多样性相似，阴道是否乳酸菌优势对HPV感染无明显影响。

3.2 宫颈HR-HPV感染与阴道厌氧菌过度生长

厌氧菌致病机制：①对宫颈阴道黏膜屏障的影响和破坏，使病毒粒子易于通过[12]；②释放细胞毒物质（酶和代谢物），分泌炎性细胞因子，产生显著的细胞病变效应。CSTⅣ菌群结构与BV 相似，都以厌氧菌过度生长，多菌性生态失调为特征。文献报道患有CSTⅣ样病症的女性阴道液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)、IL-1β、IL-4、IL-12p70、IL-10 和IL-8 升高[13]，这些促炎状态导致组织损伤，可能增强人乳头状瘤病毒的致癌潜力。研究证实这种菌群结构清除HPV的能力最差，HPV 阳性样本比例最大，而且随CIN 进展，CSTⅣ型比例增加[14]。近期研究发现宫颈HR-HPV 感染妇女的阴道微生物群的特征是大量的细菌性阴道病相关细菌(bacterial vaginosis-associated bacteria, BVAB)，具有非乳杆菌占优势的阴道微生物群的妇女感染HR-HPV 的人数成倍增加[15]。本研究中，HPV 阳性组较HPV 阴性组加德纳菌、小球藻、斯内西亚菌、奇异菌等厌氧菌属占比明显增多（18.89%vs 11.02%），还发现厌氧菌优势较乳酸菌优势并未增加HPV 感染（29.41% vs 35.44%），无优势菌型HPV 感染成倍增加（66.67%），虽结果一致，但样本量不足。鉴于宫颈HPV 感染绝大多数可以自然清除，故一般认为阴道菌群失调不是HPV 感染的必要条件，主要是影响HPV的清除能力。

3.3 阴道酸化杀菌与HPV感染、阴道菌群

一般阴道pH 值均以非乳杆菌属的比例增加而增加，将育龄妇女阴道大量乳酸杆菌的出现和pH＜4.5 定义为“健康”，但并非绝对。pH 值升高也出现在一些具有高比例乳杆菌属的群落中[7]。体内研究说明，由乳酸菌主导的阴道液pH＜4，有显著的杀灭病原体作用[16]。本研究发现，乳酸菌优势与阴道酸碱度显著相关（P＜0.01），无优势菌型全部pH 升高，推测阴道pH升高出现在多菌性菌群失调之前，乳酸杆菌减少，阴道酸化杀菌能力下降可能是导致阴道菌群失调的原因。病毒转化的人乳头瘤病毒E5 蛋白对低酸碱度特别敏感[17]，阴道酸碱度的升高有利于HPV 的复制。在一项对9 165 名哥斯达黎加妇女的研究中，显示阴道酸碱度＞5 与绝经前妇女宫颈HR-HPV 阳性风险增加10%～20%显著相关[18]。本研究中，阴道pH升高者和pH正常者相比，宫颈HRHPV 感染率由32.50% 上升到50.00%，增加了17.5%。

综上所述，若导致阴道酸碱度升高的因素长期存在，或阴道酸化杀菌功能长期丧失，则可能出现多菌性阴道菌群失调和宫颈HR-HPV 持续感染。降低阴道酸碱度可能是一种直接有效的清除HPV 感染的方法，但相关研究报道极少，需要严谨科学的研究设计，进一步进行大样本前瞻性研究。